【摘 要】
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目的：白血病是小儿常见的恶性肿瘤，其中，急性单核细胞白血病(M5)是急性髓细胞性白血病(AML)中的常见类型，M5细胞表面具有大量内毒素酯多糖(LPS)受体CD14分子表达，且单核细胞能通过CD14将与CD14抗原分子结合的分子内吞入细胞内，这为CD14作为靶向治疗M5等单核细胞相关性疾病提供了有利条件。鼠源性抗体由于其较强的免疫源性，直接用于人体可产生严重的血清病，因此，有必要对鼠源性单抗进行基
【机 构】
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浙江大学附属儿童医院血液肿瘤科 310003 浙江大学附属邵逸夫医院临床实验室 310016
【出 处】
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中华医学会第五次全国儿科中青年学术交流大会
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目的：白血病是小儿常见的恶性肿瘤，其中，急性单核细胞白血病(M5)是急性髓细胞性白血病(AML)中的常见类型，M5细胞表面具有大量内毒素酯多糖(LPS)受体CD14分子表达，且单核细胞能通过CD14将与CD14抗原分子结合的分子内吞入细胞内，这为CD14作为靶向治疗M5等单核细胞相关性疾病提供了有利条件。鼠源性抗体由于其较强的免疫源性，直接用于人体可产生严重的血清病，因此，有必要对鼠源性单抗进行基因改造，降低其免疫源性。抗体的免疫源性主要位于抗体恒定区Fc段，通过适当的方法去除鼠IgG的Fc段而保留可变区Fv段，可以大大降低鼠单抗的免疫原性而保留其识别抗原的能力。方法之一，即制成单链抗体(scFv)。为此，在真核细胞中表达ZCH-7-2F9(简称2F9)单链抗体(scFv2pg)并获得高活性的目的蛋白，为2F9其他类型的基因工程抗体及其免疫毒素的研究奠定基础。
方法：根据pSectag2A多克隆位点、(G4S)3及seFv2F9基因序列，设计含有SfiI、EcoRI酶切位点、6×His以及终止密码TGA的引物，采用高保真的Taq酶，通过重叠延伸拚接法(splicing by ovedapextension，SOE)扩增克隆到seFv2F9基因，将扩增到的目的基因片段克隆到pGEM T-easy载体，测序核实后再克隆到pSectag2A真核分泌型表达载体中。阳性重组质粒pSectag2AJscFv2F9转染中华仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)细胞进行目的蛋白的瞬时表达，将培养上清浓缩后，流式细胞术观察其对亲本单抗的阻滞效果。
结果：真核分泌型表达载体pSectag2AJscFv2F9在CHO细胞中获得成功表达，其分子量为31kDa。亲本直标单抗2F9-FTTC被真核细胞表达的scFv2F9阻滞后其阳性细胞百分数(Pereenmge)、平均荧光强度(MFI)和最高峰值(peakCh)分别下降了90.02％、63.3％和63.38％，而被转染空载体的CHO细胞培养上清阻滞后他们分别下降了4.55％、10.09％和5.02％。
结论：克隆到的2F9Vn和2F9VL基因及构建的真核分泌型表达载体pSectag2A/scFv2m是正确的，scFv2F9在CHO细胞中获得成功的表达，且有较高的识别和结合人CD14抗原的活性。
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