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目的：利用肌酸激酶Cre重组酶(MCK-Cre)小鼠和糖皮质激素受体位点(GR loxP-floxed)小鼠杂交产生肌肉特异敲除GR的小鼠(MGRKO),观察MGRKO小鼠心脏GR表达情况,证明MGRKO小鼠可以用于研究心肌特异敲除GR的实验;通过手术结扎小鼠冠状动脉前降支,复制小鼠心肌梗死模型;观察心肌细胞GR缺失(MGRKO小鼠)和GR激活(给予地塞米松注射)情况下心梗后心功能,心脏损伤情况,心梗面积,心肌细胞凋亡等情况,心脏炎症细胞和炎症因子浸润,探讨糖皮质激素及其受体对心梗的保护机制,为临床治疗寻求可能的干预靶点.
方法：1.研究对象分组:第一部分实验,实验动物雄性肌肉特异性GR敲除小鼠(MGRKO)和同窝野生小鼠(lox/lox)各40只,再分别随机分为假手术组(Sham)和手术组(MI),即lox/lox+Sham (n=12), MGRKO+Sham组(n=12), lox/lox+MI (n=28), MGRKO+MI(n=28);第二部分实验部分野生C57BL/6雄性小鼠60只,随机分为注射生理盐水组(Vehicle)和注射地塞米松组(Dex),再分别分为假手术组和手术组,即Vontrol +Sham (n=12),Dex +Sham (n=12), Vehicle+MI (n=18), Dex +MI (n=18).2.MGRKO小鼠心脏组织GR的表达检测:用免疫组化法、蛋白印迹定量法(Western Blot)、Real-time PCR法检测MGRKO小鼠心脏组织GR的表达.3.心梗模型制备:手术组小鼠是通过结扎冠状动脉前降支复制心肌梗死模型,而对照组小鼠仅穿线不结扎.4.心脏功能评估:采用小动物超声心动仪器测定小鼠心脏功能指标.5.心脏组织纤维化和瘢痕大小测定:采用Masson染色方法检测组织瘢痕纤维沉积大小.6.评价心肌肥厚指标:HW/BW检测心脏重量,WGA染色观察心肌横截面积大小.7.细胞凋亡检测:TUNEL方法检测心脏组织中细胞凋亡,Annex V/PI方法检测培养细胞凋亡和坏死情况.8.心脏组织炎症因子表达:免疫组织化学染色检测CCL5,白介素6(IL-6),肿瘤坏死因子α(TNF-α),转录生长因子β的表达(TGF-β);real-time PCR方法检测上述炎症因子的mRNA水平,CBA方法检测TNF-α和IL-6的蛋白水平.9.应用PRISM统计软件进行实验数据处理.计量资料以均数±标准差表示,分类变量以％表示.组间均数比较采用完全随机设计的单因素方差分析(One-wayANOVA),P＜0.05认为差异有统计学意义.
结果：1.利用MCK-Cre和GR loxp-floxed小鼠杂交构建肌肉特异敲除GR的小鼠(MGRKO),检测MGRKO小鼠心脏组织GR表达,发现心脏组织GR表达约减少43％.2.心梗后心脏组织糖皮质激素受体激活增加,体外培养H9C2大鼠心肌细胞系发现在缺氧处理后,磷酸化的GR表达明显增加.3.MGRKO小鼠心梗30天后心功能恶化较同窝小鼠加重,左心室射血分数和左心室短轴缩短率减小,左心室收缩末期和舒张末期内径扩大,左心室收缩末期和舒张末期心腔容积扩大.4.心脏中减少GR表达加重心梗后心脏损伤,心梗30天时心脏梗死面积增大(37.55％±2.95％.vs.19.71％±5.60％, P＜0.05),梗死壁厚度减小,扩张指数增大.5.心脏中降低GR表达增加心梗后病理性心肌肥厚,在心梗30天时,心脏重量/体重增大,心肌横截面积增大(317±35 μ m2 vs.437±93 μm2, P＜0.05).6.心脏中降低GR表达增加小鼠心梗后心脏细胞凋亡,bax/bcl-2增加.7.心脏中降低GR表达增加小鼠心脏炎症反应,TGF-β上调(1.95±0.28)倍,TNF-αmRNA表达轻微增高,上调(1.15±0.04)倍,IL-6 mRNA表达上调(2.61±0.46)倍,CCL-5因子mRNA表达上调(2.02±0.49)倍.给予地塞米松,发现给药后的小鼠的左心室射血分数较对照组明显升高,心功能改善.8.给予地塞米松组小鼠心脏梗死面积减小,提示地塞米松可以减轻梗死后心脏损伤.9.给予地塞米松后减少小鼠心梗后心肌细胞凋亡,体外培养H9C2大鼠心肌细胞系,缺氧处理后给予地塞米松组凋亡细胞明显减少.10.给予地塞米松后减轻小鼠心梗后心脏炎症反应,IL-6和CCL-5的表达水平明显下降.
结论：1.构建MGRKO小鼠,使心肌细胞上GR表达适当减少,用于研究心肌细胞上GR信号通路的作用.2.心肌细胞糖皮质激素受体对小鼠心梗后的心功能和心脏损伤具有保护作用;3.GR对心脏的保护作用可能与糖皮质激素抗炎和抗心肌细胞凋亡作用相关有关.综上所述MGRKO小鼠可以成功制备心肌细胞中GR表达减少的小鼠,可以用于观察心肌细胞GR信号通路在心梗后的作用;GR在心肌细胞表达减少后,加重心梗后心功能恶化,加重心梗后心脏重塑过程(心脏纤维化和心肌肥厚),增加心梗后心肌细胞凋亡数目,增加心梗后心脏炎症因子的水平;最后通过地塞米松处理小鼠激活GR,观察到给药后心梗小鼠心功能和心脏损伤明显改善,可能与其抗凋亡和抗炎作用相关.