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目的：(1)通过比较正常组、野百合碱诱导的肺动脉高压(Pulmonary Arterial Hypertension,PAH)四周组、六周组大鼠肺组织内白介素-6(IL-6)与核因子-κB(NF-κB)的表达及巨噬细胞的增殖情况,探讨巨噬细胞、IL-6和NF-κB在肺动脉高压中的高表达;(2)测定低氧条件下小鼠巨噬细胞各时间点(2h,6h,12h,24h,48h)的IL-6和NF-κ B的表达情况,探讨肺动脉高压中巨噬细胞内NF-κB对IL-6的表达的调控作用.
方法：1.实验动物分组:24只雄性Sprague-Dawley大鼠,随机分为3组,每组8只:①正常对照组:颈背部皮下注射生理盐水1次(1ml),饲养四周;②PAH四周组:颈背部皮下注射野百合碱(60mg/kg)1次(注射液体量约为1ml左右),饲养四周;③PAH六周组:颈背部皮下注射野百合碱(60mg/kg)1次(注射液体量约为1ml左右)饲养六周.各组大鼠饲养条件相同.2.正常对照组、PAH四周组、PAH六周组大鼠均在注射生理盐水(或野百合碱)后第28天、第28天及第42天称重麻醉后行腹部切口,由腹腔经纵隔插入右心室测量右心室收缩压及平均压.然后开胸后取出心肺.分离心脏,沿室间隔分离右心室,分别称量右心室、左心室加室间隔,计算右心室肥厚指数(RVHI).取肺组织后行福尔马林固定.3.肺血管重构的病理学表现:肺组织切片行HE染色,观察肺组织形态学变化;应用图像分析系统测定并计算各组大鼠肺中型动脉(外径51～150μ m)、小动脉(外径15～50μ m)管壁肥厚百分比(WT％).4.肺血管内炎症因子证据:肺组织切片行HE染色,观察肺血管周围淋巴细胞浸润情况.肺组织切片行免疫组化观察巨噬细胞的浸润及IL-6及NF-κ B的表达情况.5、取大鼠右肺组织,研磨后提取RNA,进行Real-time PCR (RT-PCR),测定肺组织中IL-6和NF-κ B的表达.6、行巨噬细胞培养,给予低氧刺激,测定低氧刺激条件下各时间点(2h,6h,12h,24h,48h)的IL-6和NF-κ B的表达.7.采用SPSS17.0统计软件进行统计分析,单因素方差分析比较两组间差异,以P＜0.05为差异具有统计学意义.
结果：1、MCT诱导PAH大鼠一般情况的变化注射MCT的四周组和六周组大鼠在注射MCT后第3周开始出现体毛暗淡无泽、反应迟钝、活动度下降,并且大鼠体重较前下降,四周组大鼠在第25天时死亡一只.在第6周时部分大鼠出现呼吸急促,呼吸困难,喜站立,并且在第39天,第41天,共有2只大鼠死亡.死亡大鼠解剖后可见胸腹水.2、三组大鼠血流动力学改变及右心肥厚指数三组大鼠正常组、四周组、六周组的右心室收缩压及平均压逐渐升高.根据方差分析结果提示三组大鼠右心室平均压之间差异具有统计学意义(p＜0.05),三组大鼠右心室收缩压之间差异具有统计学意义(p＜0.01),但四周组与六周组比较差异无统计学意义(p＞0.05).三组大鼠正常组、四周组、六周组右心肥厚指数逐渐升高,根据方差分析结果,三组之间差异具有统计学意义(p＜0.05).3、三组大鼠肺血管肥厚程度分析经图像分析软件对各组大鼠肺中小动脉中膜肥厚程度分析:与正常组大鼠相比,四周组与六周组大鼠肺中动脉及肺小动脉中膜厚度百分比(WT％)均增高,差异具有统计学意义(P＜0.05).4、野百合碱注射后大鼠肺组织HE染色显微镜下见淋巴细胞浸润与正常组大鼠比较,四周组和六周组大鼠HE染色后可见大量淋巴细胞浸润,特别在血管周围,并且外径大小相近的血管,四周组与六周组血管壁明显增厚.5、免疫组织化学染色后见巨噬细胞浸润增加及IL-6和NF-κB的高表达对三组大鼠肺组织分别行巨噬细胞及IL-6和NF-κB免疫组化染色,通过比较可见注射野百合碱大鼠较正常组大鼠巨噬细胞浸润明显增加,且六周组大鼠巨噬细胞侵润较四周组更为明显.IL-6和NF-κB的免疫组织染色同样可见野百合碱大鼠组较正常组的表达明显增加.6、肺组织RT-PCR检测IL-6和NF-κB的高表达各组大鼠肺组织的RT-PCR结果提示: 四周组、六周组的NF-κB的mRNA表达均较正常组增高,且差异具有统计学意义(p＜0.05),虽然六周组较四周组NF-κB的mRNA表达增加,但两组之间差异无统计学意义(p＞0.05); IL-6的mRNA表达四周组、六周组均较正常组增高,差异具有统计学意义(p＜0.05),但四周组与六周组差异无明显统计学意义(p＞0.05).并且结果显示IL-6和NF-κB的mRNA表达在各组大鼠中趋势相同.7、低氧诱导小鼠巨噬细胞中IL-6和NF-κB的mRNA表达增加采用Real time相对定量PCR对低氧条件下巨噬细胞的IL-6和NF-κBmRNA表达情况进行分析,结果表明,低氧时间分别为2h,6h,12h,24h,48h的巨噬细胞其IL-6和NF-κB的mRNA表达均较对照组增加,且两者的在各时间段内的表达趋势相同.
结论：1、应用野百合碱行肺动脉高压造模,方法简单容易操作;2、免疫组化可见巨噬细胞在肺动脉高压肺组织中浸润明显增加;3、肺动脉高压大鼠肺组织中IL-6和NF-κB高表达;4、低氧条件下巨噬细胞内IL-6和NF-κB表达增高,且表达趋势相同;5、肺动脉高压模型中IL-6的表达可以在巨噬细胞内通过NF-κ B的调控来完成.