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背景:原发性肝细胞癌(HCC)是一种常见的恶性肿瘤，恶性度极高，预后差;肝癌的治疗方法多种多样，但总体疗效较差。HCC的发生、发展是多基因多步骤的过程，随着对基因认识的不断深入，转基因技术的日趋完善，肝癌的基因治疗逐渐成为肝癌治疗研究的热点。RNAi是指由内源性或外源性短短双链RNA(dsRNA)诱导的同源mRNA的降解过程，其效应分子是21-23nt的dsRNA分子，称为小干扰RNA(siRNA);利用RNAi技术产生的基因敲除效应，可抑制癌基因、癌相关基因或突变基因等的表达。由载体表达产生的短发夹状RNA(shRNA)转染目标细胞后，被Dicer识别和裂解，产生siRNA，通过这种稳定转染的质粒载体进行表达，能够长效的抑制基因表达。CD147属于免疫球蛋白超家族成员，在肝癌等多种恶性肿瘤中表达水平明显升高，CD147可刺激其周围的成纤维细胞、内皮细胞产生基质金属蛋白酶(MMPs)，也可通过自分泌的方式增加自身MMPs的合成，破坏基底膜，从而增加肿瘤细胞的侵袭转移。
本试验通过构建CD147-shRNA表达载体并转染到肝癌细胞SMMC-7721，检测其对肝癌细胞CD147内源性表达的抑制作用，并观察对肝癌细胞生长、增殖、运动性以及对MMP-9和AFP表达的影响，以此为肝癌的基因治疗提供新的有效的靶点。pBS/U6/CD147-shRNA1、pBS/U6/CD147-shRNA2、pBS/U6/CD147-shRNA3，将3个重组质粒分别进行酶切鉴定和测序。将构建的载体转染至肝癌细胞SMMC-7721和HepG2中，用Westemblot及免疫荧光染色检测CDl47蛋白表达情况。CD147-shRNA重组质粒对肝癌细胞增殖和运动性及MMP-9和AFP表达的影响采用计数法测定SMMC-7721、SMMC-7721／pBS/U6-control、SMMC-7721/pBS/U6/CD147-shRNA3细胞生长曲线;MTT法榆测细胞增殖，计算抑制率：细胞生长抑制率(％)=[1-实验组平均A值／对照组平均A值]×100％。划痕愈合实验测定细胞迁移能力;Westemblot检测MMP-9和AFP蛋白表达。
结果:
1.CD147-shRNA重组质粒经酶切鉴定和测序，证实合成重组质粒完全正确;Westemblot检测CD147-shRNA抑制肝癌细胞SMMC-7721和HepG2内源性CD147表达的结果显示三个重组质粒均有基因沉默效果，以pBS/U6/CD147-shRNA3最为显著，可使CD147的表达水平受到70％-80％的抑制。免疫荧光方法结果显示转染pBS/U6/CD147-shRNA3后肝癌细胞荧光强度显著下降。
2.转染pBS／U6／CD147-shRNA3细胞生长速度明显减慢。SMMC-7721细胞在转染了0．3μg和1μg的pBS/U6/CD147-shRNA3后，MTT实验吸光度显著降低，并且呈剂量依赖性。最大抑制率为32．2％。HepG2细胞增殖也呈剂量依赖性地降低，降低幅度为25．4％。转染对照载体的SMMC-7721细胞在划痕24小时后趋于愈合;而转染pBS/U6/CDl47-shRNA3的SMMC-7721细胞划痕愈合能力显著减弱。肝癌HepG2细胞也有类似的结果。RNA干涉CD147后，显著地抑制了两种肝癌细胞中MMP-9的前体的生成，进而引起了活化型的减少。与对照载体相比较，pBS／U6／CD147-shRNA3可以显著地抑制肝癌细胞的肿瘤标志蛋白AFP的表达水平。可以实现80-90％左右的抑制。
结论:
1、成功构建CD147-shRNA重组质粒;转染至肝癌细胞系SMMC-7721;采用Westemblot方法和免疫荧光方法验证重组质粒特异地显著地抑制肝癌细胞CD147的蛋白表达。并筛选出抑制效果最佳的pBS／U6／CD147-shRNA3;
2、pBS／U6／CD147-shRNA3可显著地抑抑制肝癌细胞SMMC-7721和HepG2的生长速度;显著地抑制肝癌细胞的增殖;显著地降低肝癌细胞的运动能力; MMP-9和AFP水平显著下降，从而降低肝癌细胞的浸润转移能力;
3、本试验验证了CD147是肝癌发生发展过程中的重要分子，通过抑制CD147的表达可以抑制肝癌细胞生长，为选择CD147作为肝癌治疗靶点提供了理论依据。