【摘 要】
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目的：本课题采用多种分子生物学方法比较三种不同脑胶质瘤细胞(U87MG、U251、SHG44)的辐射敏感性以及60Co γ线照射对三种细胞SEMA3B基因表达的影响水平,从中挑选出最适实验研究对象以及辐照条件；培养并筛选了稳定转染pGPU6/GFP/Neo-shSEMA3B质粒的U87MG细胞；研究并探讨了SEMA3B基因沉默对U87MG辐射敏感性的影响以及60Co-γ线与SEMA3B基因沉默对细
【机 构】
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苏州大学医学部放射医学与公共卫生学院,苏州 215123
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目的：本课题采用多种分子生物学方法比较三种不同脑胶质瘤细胞(U87MG、U251、SHG44)的辐射敏感性以及60Co γ线照射对三种细胞SEMA3B基因表达的影响水平,从中挑选出最适实验研究对象以及辐照条件；培养并筛选了稳定转染pGPU6/GFP/Neo-shSEMA3B质粒的U87MG细胞；研究并探讨了SEMA3B基因沉默对U87MG辐射敏感性的影响以及60Co-γ线与SEMA3B基因沉默对细胞周期的影响,反推SEMA3B对肿瘤细胞辐射敏感性的影响；构建并评价了人脑胶质瘤裸鼠模型.方法：采用克隆形成法评价细胞的辐射敏感性,实时定量PCR检测60Co-γ线对三种胶质瘤细胞SEMA3B基因表达的影响,采用阳离子脂质体法将pGPU6/GFP/Neo-shSEMA3B质粒转染U87MG细胞,用G418筛选稳定转染的细胞并用实时定量PCR及Western-blot法评价了转染效果,用流式细胞仪检测SEMA3B基因沉默和60Co-γ线联用诱导的U87MG细胞周期分布变化,采用脑内肿瘤模型创建方法构建了人脑胶质瘤裸鼠模型.结果： (1)三种脑胶质瘤细胞的辐射敏感性SHG44＞U87MG＞U251；SHG44不表达SEMA3B,而U87MG及U251均表达SEMA3B,无论在何种剂量照射条件下U87MG中SEMA3B的表达量均高于U251(p＜0.05).SEMA3B的表达量随着照后时间的延长而升高,在72h处达到最高. (2)实时定量PCR结果示SEMA3B沉默组的SEMA3B基因表达较阴性对照组显著下降(p＜0.05)；Western-blot结果示SEMA3B蛋白的表达量较阴性对照显著下降,未见明显SEMA3B蛋白条带.(3)SEMA3B沉默组辐射敏感性较阴性对照组差.(4)SEMA3B沉默使辐照诱导的G1期阻滞较阴性对照组减少,G2期阻滞较阴性对照组增加. (5)成功建立人脑胶质瘤裸鼠模型,建立后5周出现临床症状,总平均生存时间32.71d,其中肿瘤突出体表的裸鼠的平均生存时间(40d)较未突出体表的裸鼠的平均生存时间(31.5d)长.结论：(1) U87MG细胞相较SHG44以及U251细胞具有适中的辐射抗性以及相对较高的SEMA3B表达量,是本课题的最适实验对象；4Gy 60Co-γ线照射可引起U87MG表达水平升高,且SEMA3B的表达量在72h处达到最高,是最适辐照剂量.(2) G418筛选稳定转染pGPU6/GFP/Neo-SEMA3B质粒的U87MG细胞SEMA3B沉默良好,但未达到100％沉默.(3)SEMA3B沉默组的辐射敏感性小于阴性对照组,反推出SEMA3B具有辐射增敏作用(4)SEMA3B沉默可能通过影响P53的信号传导通路,干扰P53在辐照诱导的G1期阻滞中起的作用,减少DNA损伤修复；SEMA3B沉默使辐照后G2期阻滞较阴性对照明显,使细胞在G2期的修复机会增多. (5)本实验构建的人脑胶质瘤裸鼠脑内肿瘤模型成功率81.25％,肿瘤从种植到症状出现需要5周时间,脑内肿瘤模型比皮下肿瘤模型更可靠,模拟程度更高.
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