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摘要目的：探讨靛玉红甲肟(IRO)对人喉癌Hep-2细胞增殖的影响及机制。方法：MTT法检测不同浓度、不同作用时间IRO对Hep-2细胞增殖活性的影响。流式细胞仪检测IRO对Hep-2细胞周期的影响。Western法检测IRO对Hep-2细胞CDK4和cyclin D1蛋白表达的影响。结果：MTT结果发现IRO对Hep-2细胞具有明显的增殖抑制作用，且表现为剂量依赖性(P＜0.01)。流式检测发现，以10μmol/L的IRO处理Hep-2细胞后，细胞阻滞于G0/G1期，不同浓度组间差异存在显著性(P＜0.01)。Western结果发现IRO对Hep-2细胞CDK4和cyclin D蛋白的表达有抑制作用(P＜0.01)。结论：IRO具有抑制人喉癌Hep-2细胞增殖的作用，其机制与阻滞细胞于G0/G1期有关。
关键词 喉癌 靛玉红甲肟 Hep-2 细胞周期 CDK4cyclinD1
doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2012.09.235
靛玉红是传统中成药当归中主要有效成分，在传统的中医多用于治疗慢性粒细胞性白血病等慢性疾病，近年来国内外研究表明靛玉红及其衍生物对对人类多种肿瘤细胞均有显著抑制作用［1］，但罕见其对人喉癌Hep-2系作用的报道。本文旨在研究靛玉红衍生物靛玉红甲肟(IRO)对人喉癌Hep-2细胞增殖和细胞周期的影响，并检测其对周期相关基因CDK4和cyclin D蛋白表达的影响，探讨IRO抗肿瘤的分子机制，为其临床应用提供实验依据。
材料与方法
实验材料：人喉癌Hep-2细胞株购自南京凯基生物有限公司。RPMI-1640购自杭州吉诺生物医药技术有限公司。小牛血清购自杭州四季青公司。靛玉红甲肟(Indirubin-3’-monoxime，IRO)、UA和碘化丙啶(propidium iodide，PI)染料、噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)和Trizol等试剂购自Sigma公司；β-actin，CDK4和cyclin D抗体均购自Santa Cruz。
方法：①细胞培养和药物处理：Hep-2细胞接种于含体积分数10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640完全培养液中(青霉素和链霉素各100u/ml)，置37℃、体积分数为5% CO2、饱和湿度培养箱中传代培养，取对数生长期细胞用于实验。IRO溶于DMSO配制成18mmol/L的母液，过滤除菌后-20℃备用。实验过程中DMSO终浓度不超过0.5%。②增殖抑制实验：Hep-2细胞消化收集后计数并调整细胞浓度按100μl/孔细胞悬液(1×105个细胞/ml)接种于96孔板，加入IRO终浓度为5、10、20μmol/L的RPMI-1640完全培养基，每个浓度设6个复孔，同时设阴性对照和空白对照(调零孔)各6个复孔，继续培养12、24、36、48小时。终止培养前4小时每孔加入5mg/ml MTT溶液20μl于培养箱内继续，小心吸弃培养上清液，每孔加入DMSO 150μl后与振荡器上震荡10分钟，置于酶联免疫检测仪上于570nm波长检测各孔吸光度值(A值)，按下面方式计算细胞生长抑制率，细胞生长抑制率=(对照组A值-给药组A值)/对照组A值×100%。③流式细胞仪检测凋亡细胞：Hep-2细胞贴壁后加入IRO终浓度为5、10、20μmol/L的RPMI-1640完全培养基作用48小时，各组细胞用0.25%胰蛋白酶适度消化细胞，轻轻吹打制备单细胞悬液。将细胞悬液移入新的1.5ml离心管中，4℃，500转/分，离心5分钟。小心移去上清液后用冰预冷PBS洗细胞2次，每管细胞收集数不少于106个细胞。上流式细胞仪双染检测凋亡进行参数获取和资料分析，计算细胞凋亡率。④Western蛋白印迹法检测IRO对Hep-2细胞CDK4和cyclin D蛋白表达的影响：在6孔板上培养细胞至间接近融合，加入IRO终浓度为5、10、20μmol/L的RPMI-1640完全培养基作用24小时后提取细胞总蛋白。总蛋白浓度经Bio-Rad测定后在SDS-PAGE凝胶中经电泳分离，然后转移至PVDF膜上。加稀释一抗抗体(靶蛋白抗体)静置过夜。经TBST漂洗后加入二抗孵育后荧光显色，冲洗并观察结果，扫描蛋白印迹胶片后按照靶蛋白/β-actin蛋白比例用Scion图像分析系统(4.02版本)分析条带影像。每组试验重复3遍。
统计学处理：数据均用X±S表示，采用SAS6.12和SPSS13.0统计软件进行统计学处理。MTT结果采用双因素方差分析，流式细胞仪和western结果采用单因素方差分析。检验水准为α=0.05。
结果
IRO对Hep-2细胞增殖的影响：IRO对Hep-2细胞增殖有明显抑制作用，呈现明显的浓度依赖性；不同浓度组间细胞生长抑制率差异均有显著性(F=10.85，P＜0.01)。见图1。
图1 IRO对Hep-2细胞增殖能力的影响
IRO对Hep-2细胞周期的影响：经5、10、20μmol/L的IRO作用24小时后Hep-2细胞G0/G1期细胞比例明显增加，分别增加至53.87±2.49、61.83±1.8、69.52±3.01，与对照组的46.98±2.11比较，不同时间组间差异有显著性(F=49.758，P＜0.01)；S期细胞比例明显增加，分别降低至35.15±4.53、26.21±3.56、19.87±5.72，与对照组的39.88±2.1比较，不同时间组间差异有显著性(F=13.868，P＜0.01)。见图2。
图2 IRO对Hep-2细胞周期的影响(a：control，b：5μmol/L，c：10μmol/L，d：20μmol/L)
IRO对Hep-2细胞CDK4和cyclin D蛋白表达的影响：经5、10、20μmol/L的IRO作用24小时后Hep-2细胞CDK4蛋白表达明显降低，分别降低至0.64±0.09、0.42±0.08、0.25±0.1，与对照组的0.81±0.09比较，不同时间组间差异有显著性(F=23.874，P＜0.01)；Hep-2细胞CDK4蛋白表达明显降低，分别降低至0.91±0.08、0.61±0.07、0.3±0.09，与对照组的1.08±0.09比较，不同时间组间差异有显著性(F=50.044，P＜0.01)。结果见图3。
图3 IRO作用24小时后Hep-2细胞CDK4和cyclin D蛋白的表达变化(M：marker；5μmol/L；10μmol/L；20μmol/L)
讨论
头颈部的鳞状细胞癌(SCCHN)被认为是世界第六大常见癌症。喉鳞状细胞癌(LSCC)占头颈部肿瘤的大部分。近年来研究表明喉鳞状细胞癌的发病率在中国呈逐渐上升趋势。上述数据表明，喉癌已经成为损害人类生活中最重要的癌症之一。近年来，随着喉癌手术、放射治疗等综合治疗方法的不断改进，使得喉癌患者的5年生存率及功能恢复率大为提高。然而由于喉癌生长部位的特殊性加上手术和放射治疗存在并发症多、不良反应大的问题从而给患者带来较大的痛苦。因此，急需要在化疗方面提出新的、简便、有效、不良反应小的治疗药物。靛玉红是一种二聚吲哚类化合物，自上世纪发现其对CML有明显抑制作用以来，很多研究都发现靛玉红具有巨大的抗肿瘤潜力。Yoon应用5'-Nitro-indirubinoxime作用于唾液腺导管腺癌细胞SGT系，结果发现其可以明显抑制SGT细胞的侵袭和转移［2］。还有学者发现靛玉红可以抑制肿瘤细胞的增殖，其作用机制与抑制CDKs、GSK-3和Stat 3功能密切相关［3］。本实验MTT结果显示随药物浓度增加、作用时间延长，IRO对人喉癌Hep-2细胞生长抑制率逐步增加，呈明显的浓度和时间依赖性。
细胞生长周期与细胞的增殖和凋亡密切相关，在正常细胞受损时会导致细胞周期停滞，从而给细胞自身一定时间完成修复，必要时诱导细胞凋亡。研究表明在多种肿瘤组织中都有细胞周期调控相关蛋白的异常表达，进而影响肿瘤细胞周期的进行，抑制DNA损伤的修复和凋亡的进程，从而促使肿瘤细胞的异常增殖［4］。因而修正细胞周期的进行已成为众多化疗药物的主要作用机制之一［5~6］。为此，我们观察了IRO对Hep-2细胞细胞周期的影响，结果显示随着IRO浓度的增加G0/G1期细胞比例明显增加，提示IRO可阻滞Hep-2细胞于G0/G1期而抑制Hep-2细胞的增殖。
细胞周期调控模式是指细胞周期在不同时相的多个调控点上受到调节。其中最为重要3个调控点是G1/S，G2/M和有丝分裂中期/后期的交界处，肿瘤的发生多是这些调控点上的异常失控。研究表明有三类细胞周期调控因子参与细胞周期的调控，它们分别是周期蛋白(cyclin)，细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物((CKI)，这3种因子之间的相互作用共同调节着细胞周期的进程。cyclin D1 and cdk4在肿瘤细胞和周围微环境中都发挥着重要的作用，当其抑制时细胞发展受到了抑制［7］。针对CDK4和cyclin D蛋白异常表达更正的实验也越来越受到人们的重视［8~9］。由于本次试验结果显示IRO可阻滞Hep-2细胞于G0/G1期，因而我们观察了IRO对Hep-2细胞CDK4和cyclin D蛋白表达的影响，结果显示，经IRO作用后，Hep-2细胞CDK4和cyclin D蛋白表达下降，结果提示IRO的抗肿瘤作用可能与抑制CDK4和cyclin D蛋白表达进而影响细胞周期有关。
本研究结果表明，IRO在体外对人喉癌Hep-2细胞有明显增殖抑制作用，其作用呈现出时间与剂量依赖性。其作用机制可能与下调细胞周期相关蛋白表达有关，但其具体分子机制有待进一步研究。
参考文献
1 Shi J,Shen HM.Critical role of Bid and Bax in indirubin-3'-monoxime-induced apoptosis in human cancer cells［J］.Biochem Pharmacol,2008,75(9):1729-42.
2 Yoon JH,Kim SA,Kim JI,et al.Inhibition of invasion and migration of salivary gland adenocarcinoma cells by 5'-nitro-indirubinoxime(5'-NIO)［J］.Head Neck,2010,32(5):619-25.
3 Chebel A,Kagialis-Girard S,Catallo R,et al.Indirubin derivatives inhibit m alignant lymphoid cell proliferation［J］.Leuk Lymphoma,2009,50(12):2049-60.
4 Chan CH,Lee SW,Wang J,et al.Regulation of Skp2 expression and activity and its role in cancer progression［J］.Scientific World Journal,2010,1(10):1001-15.
5 Sarita Rajender P,Ramasree D,Bhargavi K,et al.Selective inhibition of proteins regulating CDK/cyclin complexes:strategy against cancer--a review［J］.Curr Pharm Des,2011,17(3):256-71.
6 W?sierska-G?dek J,Maurer M.Promotion of apoptosis in cancer cells by selective purine-derived pharmacological CDK inhibitors: one outcome,many mechanisms［J］.J Recept Signal Transduct Res,2010,30(4):206-13.
7 Ciznadija D,Liu Y,Pyonteck SM,et al.Cyclin D1 and cdk4 mediate development of neurologically destructive oligodendroglioma［Ｊ］.Cancer Res,2011,71(19):6174-83.
8 Musgrove EA,Caldon CE,Barraclough J,et al.Cyclin D as a therapeutic target in cancer［Ｊ］.Nat Rev Cancer,2011,11(8):558-72.
9 Shimura T,Kakuda S,Ochiai Y,et al.Targeting the AKT/GSK3β/cyclin D1/Cdk4 survival signaling pathway for eradication of tumor radioresistance acquired by fractionated radiotherapy［Ｊ］.Int J Radiat Oncol Biol Phys,2011,80:150.
关键词 喉癌 靛玉红甲肟 Hep-2 细胞周期 CDK4cyclinD1
doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2012.09.235
靛玉红是传统中成药当归中主要有效成分，在传统的中医多用于治疗慢性粒细胞性白血病等慢性疾病，近年来国内外研究表明靛玉红及其衍生物对对人类多种肿瘤细胞均有显著抑制作用［1］，但罕见其对人喉癌Hep-2系作用的报道。本文旨在研究靛玉红衍生物靛玉红甲肟(IRO)对人喉癌Hep-2细胞增殖和细胞周期的影响，并检测其对周期相关基因CDK4和cyclin D蛋白表达的影响，探讨IRO抗肿瘤的分子机制，为其临床应用提供实验依据。
材料与方法
实验材料：人喉癌Hep-2细胞株购自南京凯基生物有限公司。RPMI-1640购自杭州吉诺生物医药技术有限公司。小牛血清购自杭州四季青公司。靛玉红甲肟(Indirubin-3’-monoxime，IRO)、UA和碘化丙啶(propidium iodide，PI)染料、噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)和Trizol等试剂购自Sigma公司；β-actin，CDK4和cyclin D抗体均购自Santa Cruz。
方法：①细胞培养和药物处理：Hep-2细胞接种于含体积分数10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640完全培养液中(青霉素和链霉素各100u/ml)，置37℃、体积分数为5% CO2、饱和湿度培养箱中传代培养，取对数生长期细胞用于实验。IRO溶于DMSO配制成18mmol/L的母液，过滤除菌后-20℃备用。实验过程中DMSO终浓度不超过0.5%。②增殖抑制实验：Hep-2细胞消化收集后计数并调整细胞浓度按100μl/孔细胞悬液(1×105个细胞/ml)接种于96孔板，加入IRO终浓度为5、10、20μmol/L的RPMI-1640完全培养基，每个浓度设6个复孔，同时设阴性对照和空白对照(调零孔)各6个复孔，继续培养12、24、36、48小时。终止培养前4小时每孔加入5mg/ml MTT溶液20μl于培养箱内继续，小心吸弃培养上清液，每孔加入DMSO 150μl后与振荡器上震荡10分钟，置于酶联免疫检测仪上于570nm波长检测各孔吸光度值(A值)，按下面方式计算细胞生长抑制率，细胞生长抑制率=(对照组A值-给药组A值)/对照组A值×100%。③流式细胞仪检测凋亡细胞：Hep-2细胞贴壁后加入IRO终浓度为5、10、20μmol/L的RPMI-1640完全培养基作用48小时，各组细胞用0.25%胰蛋白酶适度消化细胞，轻轻吹打制备单细胞悬液。将细胞悬液移入新的1.5ml离心管中，4℃，500转/分，离心5分钟。小心移去上清液后用冰预冷PBS洗细胞2次，每管细胞收集数不少于106个细胞。上流式细胞仪双染检测凋亡进行参数获取和资料分析，计算细胞凋亡率。④Western蛋白印迹法检测IRO对Hep-2细胞CDK4和cyclin D蛋白表达的影响：在6孔板上培养细胞至间接近融合，加入IRO终浓度为5、10、20μmol/L的RPMI-1640完全培养基作用24小时后提取细胞总蛋白。总蛋白浓度经Bio-Rad测定后在SDS-PAGE凝胶中经电泳分离，然后转移至PVDF膜上。加稀释一抗抗体(靶蛋白抗体)静置过夜。经TBST漂洗后加入二抗孵育后荧光显色，冲洗并观察结果，扫描蛋白印迹胶片后按照靶蛋白/β-actin蛋白比例用Scion图像分析系统(4.02版本)分析条带影像。每组试验重复3遍。
统计学处理：数据均用X±S表示，采用SAS6.12和SPSS13.0统计软件进行统计学处理。MTT结果采用双因素方差分析，流式细胞仪和western结果采用单因素方差分析。检验水准为α=0.05。
结果
IRO对Hep-2细胞增殖的影响：IRO对Hep-2细胞增殖有明显抑制作用，呈现明显的浓度依赖性；不同浓度组间细胞生长抑制率差异均有显著性(F=10.85，P＜0.01)。见图1。
图1 IRO对Hep-2细胞增殖能力的影响
IRO对Hep-2细胞周期的影响：经5、10、20μmol/L的IRO作用24小时后Hep-2细胞G0/G1期细胞比例明显增加，分别增加至53.87±2.49、61.83±1.8、69.52±3.01，与对照组的46.98±2.11比较，不同时间组间差异有显著性(F=49.758，P＜0.01)；S期细胞比例明显增加，分别降低至35.15±4.53、26.21±3.56、19.87±5.72，与对照组的39.88±2.1比较，不同时间组间差异有显著性(F=13.868，P＜0.01)。见图2。
图2 IRO对Hep-2细胞周期的影响(a：control，b：5μmol/L，c：10μmol/L，d：20μmol/L)
IRO对Hep-2细胞CDK4和cyclin D蛋白表达的影响：经5、10、20μmol/L的IRO作用24小时后Hep-2细胞CDK4蛋白表达明显降低，分别降低至0.64±0.09、0.42±0.08、0.25±0.1，与对照组的0.81±0.09比较，不同时间组间差异有显著性(F=23.874，P＜0.01)；Hep-2细胞CDK4蛋白表达明显降低，分别降低至0.91±0.08、0.61±0.07、0.3±0.09，与对照组的1.08±0.09比较，不同时间组间差异有显著性(F=50.044，P＜0.01)。结果见图3。
图3 IRO作用24小时后Hep-2细胞CDK4和cyclin D蛋白的表达变化(M：marker；5μmol/L；10μmol/L；20μmol/L)
讨论
头颈部的鳞状细胞癌(SCCHN)被认为是世界第六大常见癌症。喉鳞状细胞癌(LSCC)占头颈部肿瘤的大部分。近年来研究表明喉鳞状细胞癌的发病率在中国呈逐渐上升趋势。上述数据表明，喉癌已经成为损害人类生活中最重要的癌症之一。近年来，随着喉癌手术、放射治疗等综合治疗方法的不断改进，使得喉癌患者的5年生存率及功能恢复率大为提高。然而由于喉癌生长部位的特殊性加上手术和放射治疗存在并发症多、不良反应大的问题从而给患者带来较大的痛苦。因此，急需要在化疗方面提出新的、简便、有效、不良反应小的治疗药物。靛玉红是一种二聚吲哚类化合物，自上世纪发现其对CML有明显抑制作用以来，很多研究都发现靛玉红具有巨大的抗肿瘤潜力。Yoon应用5'-Nitro-indirubinoxime作用于唾液腺导管腺癌细胞SGT系，结果发现其可以明显抑制SGT细胞的侵袭和转移［2］。还有学者发现靛玉红可以抑制肿瘤细胞的增殖，其作用机制与抑制CDKs、GSK-3和Stat 3功能密切相关［3］。本实验MTT结果显示随药物浓度增加、作用时间延长，IRO对人喉癌Hep-2细胞生长抑制率逐步增加，呈明显的浓度和时间依赖性。
细胞生长周期与细胞的增殖和凋亡密切相关，在正常细胞受损时会导致细胞周期停滞，从而给细胞自身一定时间完成修复，必要时诱导细胞凋亡。研究表明在多种肿瘤组织中都有细胞周期调控相关蛋白的异常表达，进而影响肿瘤细胞周期的进行，抑制DNA损伤的修复和凋亡的进程，从而促使肿瘤细胞的异常增殖［4］。因而修正细胞周期的进行已成为众多化疗药物的主要作用机制之一［5~6］。为此，我们观察了IRO对Hep-2细胞细胞周期的影响，结果显示随着IRO浓度的增加G0/G1期细胞比例明显增加，提示IRO可阻滞Hep-2细胞于G0/G1期而抑制Hep-2细胞的增殖。
细胞周期调控模式是指细胞周期在不同时相的多个调控点上受到调节。其中最为重要3个调控点是G1/S，G2/M和有丝分裂中期/后期的交界处，肿瘤的发生多是这些调控点上的异常失控。研究表明有三类细胞周期调控因子参与细胞周期的调控，它们分别是周期蛋白(cyclin)，细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物((CKI)，这3种因子之间的相互作用共同调节着细胞周期的进程。cyclin D1 and cdk4在肿瘤细胞和周围微环境中都发挥着重要的作用，当其抑制时细胞发展受到了抑制［7］。针对CDK4和cyclin D蛋白异常表达更正的实验也越来越受到人们的重视［8~9］。由于本次试验结果显示IRO可阻滞Hep-2细胞于G0/G1期，因而我们观察了IRO对Hep-2细胞CDK4和cyclin D蛋白表达的影响，结果显示，经IRO作用后，Hep-2细胞CDK4和cyclin D蛋白表达下降，结果提示IRO的抗肿瘤作用可能与抑制CDK4和cyclin D蛋白表达进而影响细胞周期有关。
本研究结果表明，IRO在体外对人喉癌Hep-2细胞有明显增殖抑制作用，其作用呈现出时间与剂量依赖性。其作用机制可能与下调细胞周期相关蛋白表达有关，但其具体分子机制有待进一步研究。
参考文献
1 Shi J,Shen HM.Critical role of Bid and Bax in indirubin-3'-monoxime-induced apoptosis in human cancer cells［J］.Biochem Pharmacol,2008,75(9):1729-42.
2 Yoon JH,Kim SA,Kim JI,et al.Inhibition of invasion and migration of salivary gland adenocarcinoma cells by 5'-nitro-indirubinoxime(5'-NIO)［J］.Head Neck,2010,32(5):619-25.
3 Chebel A,Kagialis-Girard S,Catallo R,et al.Indirubin derivatives inhibit m alignant lymphoid cell proliferation［J］.Leuk Lymphoma,2009,50(12):2049-60.
4 Chan CH,Lee SW,Wang J,et al.Regulation of Skp2 expression and activity and its role in cancer progression［J］.Scientific World Journal,2010,1(10):1001-15.
5 Sarita Rajender P,Ramasree D,Bhargavi K,et al.Selective inhibition of proteins regulating CDK/cyclin complexes:strategy against cancer--a review［J］.Curr Pharm Des,2011,17(3):256-71.
6 W?sierska-G?dek J,Maurer M.Promotion of apoptosis in cancer cells by selective purine-derived pharmacological CDK inhibitors: one outcome,many mechanisms［J］.J Recept Signal Transduct Res,2010,30(4):206-13.
7 Ciznadija D,Liu Y,Pyonteck SM,et al.Cyclin D1 and cdk4 mediate development of neurologically destructive oligodendroglioma［Ｊ］.Cancer Res,2011,71(19):6174-83.
8 Musgrove EA,Caldon CE,Barraclough J,et al.Cyclin D as a therapeutic target in cancer［Ｊ］.Nat Rev Cancer,2011,11(8):558-72.
9 Shimura T,Kakuda S,Ochiai Y,et al.Targeting the AKT/GSK3β/cyclin D1/Cdk4 survival signaling pathway for eradication of tumor radioresistance acquired by fractionated radiotherapy［Ｊ］.Int J Radiat Oncol Biol Phys,2011,80:150.