【摘 要】
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目的 研究细粒棘球绦虫cAMP依赖性蛋白激酶A(EgPKA)基因的生物信息学特征,分析其重组蛋白的免疫反应性.方法 利用细粒棘球绦虫全基因组测序数据设计特异性引物扩增EgPKA基因
【机 构】
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重庆医科大学基础医学院病原生物学教研室,重庆400016;重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心,重庆400016;青海省人民医院,西宁810007
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目的 研究细粒棘球绦虫cAMP依赖性蛋白激酶A(EgPKA)基因的生物信息学特征,分析其重组蛋白的免疫反应性.方法 利用细粒棘球绦虫全基因组测序数据设计特异性引物扩增EgPKA基因的编码区序列,并通过生物信息学方法综合分析EgPKA蛋白的理化性质、亚细胞定位、三维结构.构建GS115/EgPKA-pPIC9K重组酵母工程菌并用甲醇诱导表达,抗His标签镍柱亲和层析柱纯化EgPKA重组蛋白,用细粒棘球蚴病患者血清、细粒棘球蚴感染的BALB/c小鼠血清作为一抗,蛋白质免疫印迹(Western blotting)分析纯化的EgPKA重组蛋白的免疫反应性.结果 EgPKA基因编码区全长1 053 bp,编码350个氨基酸残基,发生了48bp的缺失突变(417～464 bp),突变后EgPKA编码区碱基A415、G416和T465重新结合形成新的氨基酸Ser154.生物信息学分析结果显示,EgPKA理论等电点为8.63,不稳定性系数为29.04,脂肪系数为82.49,总平均亲水性为-0.374,不含信号肽,无跨膜区.Cell-Ploc 2.0软件分析结果显示,EgPKA蛋白可能定位于细胞膜、细胞质、线粒体和细胞核.Western blotting分析结果显示,1％甲醇诱导表达72 h时EgPKA重组蛋白的产量最高,纯化的EgPKA重组蛋白能与细粒棘球蚴病患者血清,细粒棘球蚴感染后4、8、12和16个月的小鼠血清发生特异性反应,出现两条分别为Mr40 000和35 000蛋白条带,而与健康小鼠及健康人血清无特异性反应,无条带出现.结论 EgPKA编码区序列存在基因缺失突变,EgPKA重组蛋白具有较好的免疫反应性,有望作为细粒棘球蚴病的早期诊断抗原.
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