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摘要：为检测牛、羊等反刍动物的气肿疽梭菌，筛选出更为特异、敏感的PCR检测方法，分别以fliA（C）、nanA、cctA为靶基因进行PCR检测，并对其敏感性、特异性等方面进行比较。结果表明，以cctA为靶基因的PCR检测方法敏感性最高，最小检测DNA量为12.30×10-5 pg/μL；以fliA（C）、nanA为靶基因的PCR检测方法敏感性较低，最小检测DNA量为0.123 ng/μL；3种靶基因引物菌未扩增出D型产气荚膜梭菌、E型产气荚膜梭菌、腐败梭菌、巴氏杆菌等基因片段，具有较好的特异性。本试验为气肿疽的快速诊断提供了更为敏感、特异的检测技术。
关键词：气肿疽梭菌；fliA（C）基因；nanA基因；cctA基因；PCR方法
中图分类号： S855.1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0278-02
收稿日期：2014-11-27
基金项目：吉林省教育科学技术研究项目[编号：吉教科合字（2014）第6号]。
作者简介：云巾宴（1990—），女，吉林长春人，硕士研究生，主要从事动物传染病学研究。E-mail：yunjinyan@hotmail.com。
通信作者：金鑫，博士，教授，主要从事动物传染病学研究。E-mail：jinxin@ybu.edu.cn。气肿疽别称黑腿病，是由气肿疽梭菌（Clostridium chauvoei）引起的牛、羊等反刍动物的急性、热性、败血性传染病[1]。动物感染气肿疽梭菌的典型症状为触诊肌肉部位有捻发音，穿刺或切开肿胀处如同天然孔，流出泡沫样的暗红色血液[2-3]。气肿疽呈散发性流行或地方性流行，一年四季均可发病，尤以炎热干旱的夏季容易发生，冬季则较少见。气肿疽梭菌的芽孢具有很强的存活力，可在土壤中存活5年之久，在腐败的尸体中也可存活3个月，因此难以从根本上预防并控制本病的发生和流行，使畜牧业蒙受巨大的经济损失[4-5]。本试验根据GenBank上已公布的气肿疽梭菌fliA（C）基因序列（AB058931）、nanA基因序列（FM213082）、cctA基因序列（JQ692583）设计了3对引物，并从特异性、敏感性方面对建立的PCR检测方法进行比较分析，以期为气肿疽的快速诊断筛选出更简便、快捷、高效的检测技术。1材料与方法
1.1模板与试剂
以气肿疽梭菌标准株C54-1全基因组DNA为模板。 r Taq DNA聚合酶购自大连宝生物工程有限公司；NI-DL 3 000 DNA Marker购自Newbio Industry公司；D型产气荚膜梭菌、E型产气荚膜梭菌、腐败梭菌、巴氏杆菌均由延边大学预防兽医学实验室保存。其他试剂均为国产分析纯。
1.2引物设计与合成
根据GenBank上已公布的气肿疽梭菌fliA（C）基因序列（AB058931）、nanA基因序列（FM213082）、cctA基因序列（JQ692583），采用Primer Premier 5.0软件设计3对特异性引物（表1），由北京新产业公司合成。
1.3DNA模板的制备及浓度测定
采用酚-三氯甲烷抽提法提取气肿疽梭菌菌体核酸DNA，并用紫外分光光度仪测定其浓度。
1.4PCR反应
以气肿疽梭菌标准株C54-1全基因组DNA为模板进行PCR反应，反应体系：10×buffer 2.5 μL、dNTP 2 μL、DNA模板2 μL、上下游引物各1 μL（10 pmol/L）、r Taq 0.25 μL，用水补齐至25 μL。以fliA（C）、nanA、cctA为靶基因，优化后的扩增程序为：95.0 ℃预变性5 min；95.0 ℃变性45 s，43.4 ℃退火 45 s，72.0 ℃延伸 45 s，35个循环；72.0 ℃延伸10 min，4.0 ℃反应结束。95.0 ℃预变性5 min；95.0 ℃变性45 s，42.5 ℃退火 45 s，720 ℃延伸45 s，35个循环；72.0 ℃延伸10 min，4.0 ℃ 反应结束。95.0 ℃预变性5 min；95.0 ℃变性45 s，488 ℃退火 45 s，72.0 ℃延伸45 s，30个循环；72.0 ℃延伸 10 min，4.0 ℃ 反应结束。采用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。
1.5特异性试验
以D型产气荚膜梭菌、E型产气荚膜梭菌、腐败梭菌、巴氏杆菌的基因组DNA为模板，以灭菌去离子水为阴性对照，分别用3对特异性引物进行PCR扩增，以判断其特异性。
1.6敏感性试验
提取气肿疽梭菌菌体DNA并测其D260 nm值，将DNA模板按1 ∶10比例连续稀释后，分别用3对特异性引物进行PCR扩增。采用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，以确定PCR方法的敏感性。
2结果与分析
2.1基因组DNA的浓度
提取气肿疽梭菌标准株C54-1菌体DNA后，采用紫外分光光度计测定其D260 nm值，计算得到DNA浓度为12.3 ng/μL。
2.2特异性试验结果
分别以气肿疽梭菌、D型产气荚膜梭菌、E型产气荚膜梭菌、腐败梭菌、巴氏杆菌的基因组DNA为模板，以灭菌去离子水为阴性对照，按照“1.4”节的扩增体系和反应条件，采用3对特异性引物进行PCR扩增，并采用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测结果。结果（图1）显示，气肿疽梭菌扩增出了特异性目的条带，而其他均未出现目的条带，表明3种靶基因的PCR检测方法均具有较好的特异性。
2.3敏感性试验结果
将气肿疽梭菌菌体DNA标准品按1 ∶10比例稀释后，采用上述PCR方法进行扩增，并采用琼脂糖凝胶电泳检测结果。结果（图2）显示，3种靶基因的PCR检测方法中，以cctA为靶基因的PCR方法敏感性最高，最小检测DNA量为 12.30 fg/μL；以fli（A）、nanA为靶基因的PCR方法敏感性较低，最小检测DNA量同为123.0 pg/μL。 3结论与讨论
目前，诊断牛、羊等反刍动物的气肿疽病主要采用间接ELISA、普通PCR、实时荧光定量PCR、套式PCR、二重PCR、多重实时定量PCR等分子生物学诊断方法[6-11]。PCR检测方法因其特异性强、灵敏度高而被广泛采用，但由于不同基因的开放阅读框稳定性不同，其特异性、敏感性受到不同程度的影响；因此，有必要筛选出特异性好、敏感度高的气肿疽病PCR诊断方法。
近年来，Moussa报道的气肿疽梭菌鞭毛蛋白不仅是一种重要的保护性抗原，也是引起生物体感染和发病的重要毒力因子[12]。唾液酸酶别称神经氨酸酶、NanA，分子质量为81 ku，编码722个氨基酸，是由2个分子质量为72 ku的多肽所组成的150 ku的二聚体。该酶可作为反刍动物抵抗病原体入侵、防治黑腿病感染的优秀候选基因[13]。气肿疽梭菌细胞毒素A（CctA）是Frey等通过全基因序列分析得出的一种新型蛋白质毒素，该毒素是细菌毒素的杀白细胞素总科、β-微孔形成毒素家族中的一种。细胞毒素A是气肿疽梭菌的主要细胞毒素和溶血素，也是黑腿病疫苗研究中极具价值的候选基因[14]。本试验根据GenBank上已公布的气肿疽梭菌fliA（C）基因序列（AB058931）、nanA基因序列（FM213082）、cctA基因序列（JQ692583）设计了3对引物，并从特异性、敏感性方面对建立的PCR检测方法进行比较分析。结果表明，3对引物均具有较强的特异性，而以cctA为靶基因设计的引物最为敏感，其最小检测DNA量为1.230×10-5 pg/μL。本试验通过比较不同靶基因PCR检测方法，筛选出以cctA为靶基因引物的PCR方法，为气肿疽病临床诊断提供了可靠技术手段。
参考文献：
[1]王正兴. 山区牛气肿疽诊断与防制[J]. 上海畜牧兽医通讯，2011（2）：107.
[2]陆安法，徐官红，简廷安，等. 牛气肿疽的防制[J]. 动物医学进展，2003，24（6）：131-131.
[3]姜丹丹. 气肿疽梭菌单克隆抗体的制备及胶体金诊断试纸条的研制[D].延吉：延边大学，2013：1-45.
[4]白实，郭宇鹏，李艳华，等. 敦化地区黄牛气肿疽的防治与诊断[J]. 吉林畜牧兽医，2007，28（6）：38-39.
[5]Groseth P K，Ersdal C，Bjelland A M，et al. Large outbreak of blackleg in housed cattle[J]. The Veterinary Record，2011，169（13）：339.
[6]车达，金鑫，陈莹莹，等. 延边黄牛气肿疽间接ELISA诊断方法的建立[J]. 安徽农业科学，2011，39（2）：1042-1044.
[7]Uzal F A，Hugenholtz P，Blackall L L，et al. PCR detection of Clostridium chauvoei in pure cultures and in formalin-fixed，paraffin-embedded tissues[J]. Veterinary Microbiology，2003，91（2/3）：239-248.
[8]Halm A，Wagner M，Kfer J，et al. Novel real-time PCR assay for simultaneous detection and differentiation of Clostridium chauvoei and Clostridium septicum in clostridial myonecrosis[J]. Journal of Clinical Microbiology，2010，48（4）：1093-1098.
[9]姜丹丹，金鑫，陈莹，等. 气肿疽梭菌套式PCR检测方法的建立[J]. 中国兽医科学，2010，40（11）：1171-1174.
[10]彭小兵，李旭妮，王楠，等. 二重PCR方法鉴别气肿疽梭菌和腐败梭菌[J]. 中国兽药杂志，2011，45（3）：20-22.
[11]Lange M，Neinrich H，Seyboldt C. Development and validation of a multiplex real-time PCR for detection of Clostridium[J]. Molecular and Cellular Probes，2010，24（4）：204-210.
[12]Kojima A，Uchida I，Sekizaki T，et al. Cloning and expression of a gene encoding the flagellin of Clostridium chauvoei[J]. Veterinary Microbiology，2000，76（4）：359-372.
[13]Vimr E R，Kalivoda K A，Deszo E L，et al. Diversity of microbial sialic acid metabolism[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews，2004，68（1）：132-153.
[14]Frey J，Johansson A，Bürki S，et al. Cytotoxin CctA，a major virulence factor of Clostridium chauvoei conferring protective immunity against myonecrosis[J]. Vaccine，2012，30（37）：5500-5505.陈圆，张龙，王莹，等. 金雀异黄素壳聚糖纳米粒子体外释放动力学研究[J]. 江苏农业科学，2015，43（11
：280-282.
关键词：气肿疽梭菌；fliA（C）基因；nanA基因；cctA基因；PCR方法
中图分类号： S855.1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0278-02
收稿日期：2014-11-27
基金项目：吉林省教育科学技术研究项目[编号：吉教科合字（2014）第6号]。
作者简介：云巾宴（1990—），女，吉林长春人，硕士研究生，主要从事动物传染病学研究。E-mail：yunjinyan@hotmail.com。
通信作者：金鑫，博士，教授，主要从事动物传染病学研究。E-mail：jinxin@ybu.edu.cn。气肿疽别称黑腿病，是由气肿疽梭菌（Clostridium chauvoei）引起的牛、羊等反刍动物的急性、热性、败血性传染病[1]。动物感染气肿疽梭菌的典型症状为触诊肌肉部位有捻发音，穿刺或切开肿胀处如同天然孔，流出泡沫样的暗红色血液[2-3]。气肿疽呈散发性流行或地方性流行，一年四季均可发病，尤以炎热干旱的夏季容易发生，冬季则较少见。气肿疽梭菌的芽孢具有很强的存活力，可在土壤中存活5年之久，在腐败的尸体中也可存活3个月，因此难以从根本上预防并控制本病的发生和流行，使畜牧业蒙受巨大的经济损失[4-5]。本试验根据GenBank上已公布的气肿疽梭菌fliA（C）基因序列（AB058931）、nanA基因序列（FM213082）、cctA基因序列（JQ692583）设计了3对引物，并从特异性、敏感性方面对建立的PCR检测方法进行比较分析，以期为气肿疽的快速诊断筛选出更简便、快捷、高效的检测技术。1材料与方法
1.1模板与试剂
以气肿疽梭菌标准株C54-1全基因组DNA为模板。 r Taq DNA聚合酶购自大连宝生物工程有限公司；NI-DL 3 000 DNA Marker购自Newbio Industry公司；D型产气荚膜梭菌、E型产气荚膜梭菌、腐败梭菌、巴氏杆菌均由延边大学预防兽医学实验室保存。其他试剂均为国产分析纯。
1.2引物设计与合成
根据GenBank上已公布的气肿疽梭菌fliA（C）基因序列（AB058931）、nanA基因序列（FM213082）、cctA基因序列（JQ692583），采用Primer Premier 5.0软件设计3对特异性引物（表1），由北京新产业公司合成。
1.3DNA模板的制备及浓度测定
采用酚-三氯甲烷抽提法提取气肿疽梭菌菌体核酸DNA，并用紫外分光光度仪测定其浓度。
1.4PCR反应
以气肿疽梭菌标准株C54-1全基因组DNA为模板进行PCR反应，反应体系：10×buffer 2.5 μL、dNTP 2 μL、DNA模板2 μL、上下游引物各1 μL（10 pmol/L）、r Taq 0.25 μL，用水补齐至25 μL。以fliA（C）、nanA、cctA为靶基因，优化后的扩增程序为：95.0 ℃预变性5 min；95.0 ℃变性45 s，43.4 ℃退火 45 s，72.0 ℃延伸 45 s，35个循环；72.0 ℃延伸10 min，4.0 ℃反应结束。95.0 ℃预变性5 min；95.0 ℃变性45 s，42.5 ℃退火 45 s，720 ℃延伸45 s，35个循环；72.0 ℃延伸10 min，4.0 ℃ 反应结束。95.0 ℃预变性5 min；95.0 ℃变性45 s，488 ℃退火 45 s，72.0 ℃延伸45 s，30个循环；72.0 ℃延伸 10 min，4.0 ℃ 反应结束。采用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。
1.5特异性试验
以D型产气荚膜梭菌、E型产气荚膜梭菌、腐败梭菌、巴氏杆菌的基因组DNA为模板，以灭菌去离子水为阴性对照，分别用3对特异性引物进行PCR扩增，以判断其特异性。
1.6敏感性试验
提取气肿疽梭菌菌体DNA并测其D260 nm值，将DNA模板按1 ∶10比例连续稀释后，分别用3对特异性引物进行PCR扩增。采用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，以确定PCR方法的敏感性。
2结果与分析
2.1基因组DNA的浓度
提取气肿疽梭菌标准株C54-1菌体DNA后，采用紫外分光光度计测定其D260 nm值，计算得到DNA浓度为12.3 ng/μL。
2.2特异性试验结果
分别以气肿疽梭菌、D型产气荚膜梭菌、E型产气荚膜梭菌、腐败梭菌、巴氏杆菌的基因组DNA为模板，以灭菌去离子水为阴性对照，按照“1.4”节的扩增体系和反应条件，采用3对特异性引物进行PCR扩增，并采用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测结果。结果（图1）显示，气肿疽梭菌扩增出了特异性目的条带，而其他均未出现目的条带，表明3种靶基因的PCR检测方法均具有较好的特异性。
2.3敏感性试验结果
将气肿疽梭菌菌体DNA标准品按1 ∶10比例稀释后，采用上述PCR方法进行扩增，并采用琼脂糖凝胶电泳检测结果。结果（图2）显示，3种靶基因的PCR检测方法中，以cctA为靶基因的PCR方法敏感性最高，最小检测DNA量为 12.30 fg/μL；以fli（A）、nanA为靶基因的PCR方法敏感性较低，最小检测DNA量同为123.0 pg/μL。 3结论与讨论
目前，诊断牛、羊等反刍动物的气肿疽病主要采用间接ELISA、普通PCR、实时荧光定量PCR、套式PCR、二重PCR、多重实时定量PCR等分子生物学诊断方法[6-11]。PCR检测方法因其特异性强、灵敏度高而被广泛采用，但由于不同基因的开放阅读框稳定性不同，其特异性、敏感性受到不同程度的影响；因此，有必要筛选出特异性好、敏感度高的气肿疽病PCR诊断方法。
近年来，Moussa报道的气肿疽梭菌鞭毛蛋白不仅是一种重要的保护性抗原，也是引起生物体感染和发病的重要毒力因子[12]。唾液酸酶别称神经氨酸酶、NanA，分子质量为81 ku，编码722个氨基酸，是由2个分子质量为72 ku的多肽所组成的150 ku的二聚体。该酶可作为反刍动物抵抗病原体入侵、防治黑腿病感染的优秀候选基因[13]。气肿疽梭菌细胞毒素A（CctA）是Frey等通过全基因序列分析得出的一种新型蛋白质毒素，该毒素是细菌毒素的杀白细胞素总科、β-微孔形成毒素家族中的一种。细胞毒素A是气肿疽梭菌的主要细胞毒素和溶血素，也是黑腿病疫苗研究中极具价值的候选基因[14]。本试验根据GenBank上已公布的气肿疽梭菌fliA（C）基因序列（AB058931）、nanA基因序列（FM213082）、cctA基因序列（JQ692583）设计了3对引物，并从特异性、敏感性方面对建立的PCR检测方法进行比较分析。结果表明，3对引物均具有较强的特异性，而以cctA为靶基因设计的引物最为敏感，其最小检测DNA量为1.230×10-5 pg/μL。本试验通过比较不同靶基因PCR检测方法，筛选出以cctA为靶基因引物的PCR方法，为气肿疽病临床诊断提供了可靠技术手段。
参考文献：
[1]王正兴. 山区牛气肿疽诊断与防制[J]. 上海畜牧兽医通讯，2011（2）：107.
[2]陆安法，徐官红，简廷安，等. 牛气肿疽的防制[J]. 动物医学进展，2003，24（6）：131-131.
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[6]车达，金鑫，陈莹莹，等. 延边黄牛气肿疽间接ELISA诊断方法的建立[J]. 安徽农业科学，2011，39（2）：1042-1044.
[7]Uzal F A，Hugenholtz P，Blackall L L，et al. PCR detection of Clostridium chauvoei in pure cultures and in formalin-fixed，paraffin-embedded tissues[J]. Veterinary Microbiology，2003，91（2/3）：239-248.
[8]Halm A，Wagner M，Kfer J，et al. Novel real-time PCR assay for simultaneous detection and differentiation of Clostridium chauvoei and Clostridium septicum in clostridial myonecrosis[J]. Journal of Clinical Microbiology，2010，48（4）：1093-1098.
[9]姜丹丹，金鑫，陈莹，等. 气肿疽梭菌套式PCR检测方法的建立[J]. 中国兽医科学，2010，40（11）：1171-1174.
[10]彭小兵，李旭妮，王楠，等. 二重PCR方法鉴别气肿疽梭菌和腐败梭菌[J]. 中国兽药杂志，2011，45（3）：20-22.
[11]Lange M，Neinrich H，Seyboldt C. Development and validation of a multiplex real-time PCR for detection of Clostridium[J]. Molecular and Cellular Probes，2010，24（4）：204-210.
[12]Kojima A，Uchida I，Sekizaki T，et al. Cloning and expression of a gene encoding the flagellin of Clostridium chauvoei[J]. Veterinary Microbiology，2000，76（4）：359-372.
[13]Vimr E R，Kalivoda K A，Deszo E L，et al. Diversity of microbial sialic acid metabolism[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews，2004，68（1）：132-153.
[14]Frey J，Johansson A，Bürki S，et al. Cytotoxin CctA，a major virulence factor of Clostridium chauvoei conferring protective immunity against myonecrosis[J]. Vaccine，2012，30（37）：5500-5505.陈圆，张龙，王莹，等. 金雀异黄素壳聚糖纳米粒子体外释放动力学研究[J]. 江苏农业科学，2015，43（11
：280-282.