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摘要 [目的]筛选出适合于cDNA文库构建的猪苓菌核及菌丝体总RNA的提取方法。[方法]采用Trizol改良法和EASY Spin植物快速提取试剂盒法（简称试剂盒法）对猪苓菌丝及菌核的总RNA进行提取。[结果]经紫外分光光度计对所得总RNA的均一性及1%琼脂糖凝胶电泳对所得总RNA的完整性检测后发现，2种方法均可提出完整的总RNA，试剂盒法相较于Trizol改良法其所提取的总RNA质量和纯度都较好，但Trizol改良法所提取的总RNA产率比较高。[结论]LD-PCR成功合成了猪苓菌核和菌丝体的cDNA产物，呈弥散状分布在1 000～5 000 bp和750～2 500 bp，满足cDNA建库的要求。
关键词 猪苓；菌丝；菌核；总RNA提取方法
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）02-0063-03
Abstract [Objective]To screen out the method for extracting total RNA from Polyporus umbellatus mycelium and sclerotium suitable for cDNA library construction. [Method]The total RNA of mycelium and sclerotium of P. umbellatus was extracted by improved Trizol method and EASY Spin plant RNA kit method（kit method for short）. [Result]The total RNA was homogenized by UV spectrophotometer and the integrity of the obtained total RNA was detected by 1% agarose gel electrophoresis. It was found that both methods could provide the complete total RNA. Compared with the kit method， the total RNA extracted by the improved Trizol method was better in quality and purity， but the total RNA extracted by improved Trizol method had higher yield. The cDNA of mycelium and sclerotium of P. umbellatus was successfully synthesized by LDPCR and distributed in the range of 1 000-5 000 bp and 750-2 500 bp， which satisfied the requirement of cDNA library construction.
Key words Polyporus umbellatus；Mycelium；Sclerotium；Total RNA extraction method
cDNA文库构建是现代生物技术研究中一项很重要的技术，是大规模与高效率获得基因序列的有效途径，特别是对基因组庞大且短期内不能进行全基因组测序的某些物种来说，其是有效开展功能基因组研究的一条重要途径[1]。通过构建全长cDNA文库能够直接发现并克隆与生命活动有关的调控基因，进而阐述其基因所编码的蛋白质性质及其相互作用的关系。然而，构建高质量的全长cDNA文库并不容易，要获得完整的mRNA就是一个棘手问题。目前从细胞中提取总RNA的方法很多，通常采用的方法有Trizol法、改良CTAB 法、SDS酸酚法、异硫氰酸胍-CTAB法、异硫氰酸胍-SDS法等，提取纯度高、完整性好的mRNA是顺利构建cDNA文库、RT-PCR以及EST序列分析等分子生物学研究的关键[2-4]。为此，许多公司制定和生产了用于提取不同物种总RNA的方法和试剂盒，但不同物种细胞组织中所含的成分（多糖、多酚等）有很大差异，因此，不同方法和不同厂家的试剂盒间也各有优缺点。
猪苓[Polyporus umbellatus（Pers.）Fr.] 是一种药用大型真菌，在分类学上属于无隔担子菌亚纲（Holobasidiomycetidae）、 无褶菌目（Aphyllophorales）、 多孔菌科（Polyporaceae）、 多孔菌屬（Polyporus）。猪苓主要分布于我国陕西等西南省区和东北长白山区[5]。Xing等[6]通过分析比对nr DNA ITS和28s rRNA（LSU）序列认为猪苓的种群发源地应是陕西省和甘肃省。猪苓的生长过程可分为菌丝体萌发、菌核生长和子实体形成三个阶段。生长3年的菌核（黑苓）才可作为药材，一般认为，猪苓菌核生长周期长，细胞趋于木质化[7]，在菌核中会大量富集多糖、酚类等次生代谢产物。尤其是酚类物质易被氧化成醌，与RNA不可逆地结合，增加了提取足够质量与纯度的总RNA的难度。目前还少有关于从猪苓菌核中提取总RNA方法的文献报道。笔者以产于陕西的猪苓菌核及菌丝体为试材，通过Trizol改良法和EASY Spin植物快速提取试剂盒法（简称试剂盒法）提取总RNA，探索提取猪苓菌核及菌丝体总RNA的最适方法，为后续构建陕西猪苓菌核及菌丝体的cDNA文库奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试材料。
猪苓菌核为采自于陕西省佛坪县的3年生黑苓，菌丝体采用组织分离法从猪苓菌核中分离获得，再经转管活化和扩繁后保存于延边大学农学院微生物实验室。 1.1.2 供试试剂。
1.1.2.1 RNA提取试剂。
TrizolReagent 购于Invitrogen公司；EASY Spin植物快速提取试剂盒购于北京艾德莱生物科技有限公司。
1.1.2.2 其他试剂。
DEPC 购于Solarbio 公司；Advantage 2 PCR kit 购于Clontech 公司；其他常规生化试剂均为国产分析纯。
1.1.3 供试引物。
SMART ⅣTM Oligonucleotide（12 μmol/L）5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCG GG-3’；CDS Ⅲ/3’ PCR Primer（12 μmol/L）5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d（T）30N-1N-3’。
1.2 方法
1.2.1 豬苓菌核及菌丝体中总RNA提取。
1.2.1.1 Trizol改良法[8]。
取1.5 mL预冷后EP管，分别加入80 mg 经液氮研磨后的猪苓菌核及菌丝体粉末，经1 mL Trizol试剂的裂解后，加入氯仿产生有机相，离心取上清后加入等体积的水饱和酚、三氯甲烷和异戊醇去除蛋白质[9]，离心取上清后用异丙醇沉淀RNA[10]，离心去上清后由75% 乙醇清洗沉淀2～3 次，最后用DEPC水溶解沉淀。
1.2.1.2 试剂盒法。
参照EASY Spin 植物RNA快速提取试剂盒说明书的方法进行操作。
1.2.2 总RNA检测。
用紫外分光光度法检测提取总RNA的均一性；用1%琼脂糖凝胶、TAE缓冲液电泳检测所得总RNA的完整性。
1.2.3 猪苓菌核及菌丝体cDNA的合成。
1.2.3.1 cDNA第一链的合成。
向0.5 mL EP管中加入3 μL 总RNA、1 μL SMART ⅣTM Oligonucleotide、1 μL CDS Ⅲ/3’ PCR Primer，瞬时离心。72 ℃孵育2 min，冰上冷却2 min，瞬时离心。再按顺序加入2 μL 5×FirstStrand Buffer、1 μL DTT（20 mmol/L）、1 μL dNTP Mix（10 mmol/L）、1 μL SMARTScribeTM MMLV Reverse Transcriptase，反应体系为10 μL，轻轻混合。42 ℃水浴1 h，将管置于冰上终止反应。
2 结果与分析
2.1 RNA完整性检测
采用2种提取方法都可以从猪苓菌核和菌丝体中提取出总RNA，由图1和图2的电泳结果可见，都出现了总RNA的28S、18S、5S这3条条带。但是Trizol改良法的5S条带拖尾现象比较严重，说明Trizol改良法提取的总RNA存在着降解问题，可能是RNase酶未去除干净或温度过高导致RNA单链断裂，致使RNA降解；而试剂盒法提取出的RNA，3条带比较清晰，意味着RNA没有出现蛋白质残留或DNA污染等现象，而且28S的亮度约为18S的2倍，表明提取的总RNA完整性很高，没有发生降解。
2.2 RNA均一性检测
用紫外分光光度计测定OD260/280来检验所提取总RNA的均一性，当OD260/280值过小时，表明有蛋白质或酚污染；当OD260/280值大于2.2时，意味着RNA已经降解成单核酸了[10-11]。由表1可知，采用试剂盒法提取总RNA的OD260/280比值均为1.7～2.1，表明总RNA纯度很高；而采用Trizol改良法提取总RNA的OD260/280比值大于22，表明总RNA已经降解。但是，相比Trizol改良法，试剂盒法提取的总RNA产量偏低，推测是样品在用基因组DNA清除柱清除残留DNA时RNA的产量也严重降低。猪苓菌核中的总RNA产量明显低于菌丝体中的总RNA产量，其原因可能是因为菌核处于休眠状态，活性较弱，且菌核细胞趋于木质化，裂解难度增大，导致总RNA产量比较低。
2.3 LD-PCR扩增cDNA
通过对猪苓菌核及菌丝体的cDNA合成和LD-PCR扩增，经电泳检测扩增产物，其结果见图3、4。猪苓菌核和菌丝体的引物扩增条带弥散分别分布在1 000～5 000 bp和750～2 500 bp，说明它们的cDNA扩增带的丰度和长度均符合cDNA文库构建条件。
3 讨论与结论
猪苓菌核细胞内含有较多的多糖和麦角甾醇，而且其含量随年份增加亦明显升高，而用液体发酵培养的菌丝体多糖和麦角甾醇含量更是高于菌核[12]。猪苓菌核是由拟薄壁组织和疏丝组织形成的一种休眠体，是菌核贮藏养分的器官[13]，这些因素都明显增加了猪苓菌核及菌丝体总RNA的提取难度。栾换东等[14]采用Trizol法、Trizol改良1法、Trizol改良2法及CTAB改良法对长白山猪苓菌丝体总RNA的提取结果表明，Trizol法存在多糖多酚污染，影响了RNA的完整性，CTAB改良法耗时较长，产率比较低，Trizol改良1法、Trizol改良2法提取的总RNA无论是完整性还是纯度均较Trizol法与CTAB改良法好。秦亚丽[15]分别采用Trizol试剂法、RNAiso plus法、RNAiso plus搭配RNAisomate for Plant Tissue法、CTABLiCl法及Trizol Reagent法共5种方法对陕西猪苓菌丝体总RNA进行提取，结果表明CTAB法与Trizol Reagent法所提出的RNA产率低，且OD260/280也达不到要求；Trizol法与RNAiso plus法虽得出了明显的条带，但存在蛋白质或多糖污染，而RNAiso plus搭配RNAisomate for Plant Tissue法经改良后得到的RNA质量和产量都很好。 鉴于猪苓菌核特殊的结构和在提取总RNA时出现的困难，笔者认为需要注意以下几点：①加入裂解液前要保证猪苓样品一直处于冷冻的状态；②针对猪苓菌核难提取易降解的情况，可适当增加裂解液的量并延长裂解液与猪苓样品接触的时间；③用提前预热到75～85 ℃的RNasefree H2O溶解RNA，这些可以在一定程度上提高总RNA产量。
该研究采用了Trizol改良法和试剂盒法2种不同的方法提取猪苓菌核和菌丝体的总RNA。Trizol试剂作为普遍的RNA提取試剂，虽然成功率高，但所得总RNA纯度较低，完整性较差，易降解；而试剂盒法比较简便，且提取时间短，通常30 min就可以完成，所得RNA纯度比较高，完整性也较好。
参考文献
[1] 姜静.分子生物学实验原理与技术[M].哈尔滨：东北林业大学出版社，2003.
[2] 萨姆布鲁克 J，拉塞尔 D W.分子克隆实验指南（上册）[M].北京：科学出版社，2005.
[3] BUTT R H，PFEIFER T A，DELANEY A，et al.Enabling coupled quantitative genomics and proteomics analyses from rat spinal cord samples[J].Mol Cell Proteomics，2007，6（9）：1574-1588.
[4] 周玉婷，王钰.苹果RNA提取方法的探索[J].运城学院学报，2010，28（5）：43-44.
[5] 许广波，傅伟杰，赵旭奎.我国猪苓研究的进展[J].菌物研究，2003，1 （1）：58-61.
[6] XING X K，MA X T，HART M M，et al.Genetic diversity and evolution of Chinese traditional medicinal fungus Polyporus umbellatus（Polyporales，Basidiomycota）[J].Plos one，2013，8（3）：1-10.
[7] 郭顺星，徐锦堂.猪苓菌核结构性质的研究[J].菌物学报，1991，10（4）：312-317.
[8] 杨楠，徐正进，周永力.改良TRIZOL法提取高质量稻曲病菌总RNA的方法[J].现代农业科技，2008（11）：145-149.
[9] 王阿娜，裴瑾，刘薇，等.桑叶片总RNA提取方法的比较研究[J].中成药，2012，34（7）：1377-1380.
[10] 张晓丽，代红军.植物RNA提取方法的研究进展[J].北方园艺，2014（8）：175-178.
[11]汪天虹.分子生物学实验[M].北京：北京大学出版社，2008：36.
[12] 李雯瑞，梁宗锁，陈德育，等.不同发育阶段猪苓菌核显微结构和成分含量的比较[J].西北林学院学报，2013，28（4）：116-121.
[13] 周微微.猪苓菌核及发酵菌丝体化学成分研究及质量分析[D].北京：中国协和医科大学，2008.
[14] 栾换东，战莹莹，姜颖越，等.长白山药用真菌鸡爪苓菌丝体总RNA提取方法的比较[J].延边大学农学学报，2014，36（4）：297-301.
[15] 秦亚丽.猪苓遗传多样性及多糖合成酶-UGPase基因的克隆[D].杨凌：西北农林科技大学，2012.
关键词 猪苓；菌丝；菌核；总RNA提取方法
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）02-0063-03
Abstract [Objective]To screen out the method for extracting total RNA from Polyporus umbellatus mycelium and sclerotium suitable for cDNA library construction. [Method]The total RNA of mycelium and sclerotium of P. umbellatus was extracted by improved Trizol method and EASY Spin plant RNA kit method（kit method for short）. [Result]The total RNA was homogenized by UV spectrophotometer and the integrity of the obtained total RNA was detected by 1% agarose gel electrophoresis. It was found that both methods could provide the complete total RNA. Compared with the kit method， the total RNA extracted by the improved Trizol method was better in quality and purity， but the total RNA extracted by improved Trizol method had higher yield. The cDNA of mycelium and sclerotium of P. umbellatus was successfully synthesized by LDPCR and distributed in the range of 1 000-5 000 bp and 750-2 500 bp， which satisfied the requirement of cDNA library construction.
Key words Polyporus umbellatus；Mycelium；Sclerotium；Total RNA extraction method
cDNA文库构建是现代生物技术研究中一项很重要的技术，是大规模与高效率获得基因序列的有效途径，特别是对基因组庞大且短期内不能进行全基因组测序的某些物种来说，其是有效开展功能基因组研究的一条重要途径[1]。通过构建全长cDNA文库能够直接发现并克隆与生命活动有关的调控基因，进而阐述其基因所编码的蛋白质性质及其相互作用的关系。然而，构建高质量的全长cDNA文库并不容易，要获得完整的mRNA就是一个棘手问题。目前从细胞中提取总RNA的方法很多，通常采用的方法有Trizol法、改良CTAB 法、SDS酸酚法、异硫氰酸胍-CTAB法、异硫氰酸胍-SDS法等，提取纯度高、完整性好的mRNA是顺利构建cDNA文库、RT-PCR以及EST序列分析等分子生物学研究的关键[2-4]。为此，许多公司制定和生产了用于提取不同物种总RNA的方法和试剂盒，但不同物种细胞组织中所含的成分（多糖、多酚等）有很大差异，因此，不同方法和不同厂家的试剂盒间也各有优缺点。
猪苓[Polyporus umbellatus（Pers.）Fr.] 是一种药用大型真菌，在分类学上属于无隔担子菌亚纲（Holobasidiomycetidae）、 无褶菌目（Aphyllophorales）、 多孔菌科（Polyporaceae）、 多孔菌屬（Polyporus）。猪苓主要分布于我国陕西等西南省区和东北长白山区[5]。Xing等[6]通过分析比对nr DNA ITS和28s rRNA（LSU）序列认为猪苓的种群发源地应是陕西省和甘肃省。猪苓的生长过程可分为菌丝体萌发、菌核生长和子实体形成三个阶段。生长3年的菌核（黑苓）才可作为药材，一般认为，猪苓菌核生长周期长，细胞趋于木质化[7]，在菌核中会大量富集多糖、酚类等次生代谢产物。尤其是酚类物质易被氧化成醌，与RNA不可逆地结合，增加了提取足够质量与纯度的总RNA的难度。目前还少有关于从猪苓菌核中提取总RNA方法的文献报道。笔者以产于陕西的猪苓菌核及菌丝体为试材，通过Trizol改良法和EASY Spin植物快速提取试剂盒法（简称试剂盒法）提取总RNA，探索提取猪苓菌核及菌丝体总RNA的最适方法，为后续构建陕西猪苓菌核及菌丝体的cDNA文库奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试材料。
猪苓菌核为采自于陕西省佛坪县的3年生黑苓，菌丝体采用组织分离法从猪苓菌核中分离获得，再经转管活化和扩繁后保存于延边大学农学院微生物实验室。 1.1.2 供试试剂。
1.1.2.1 RNA提取试剂。
TrizolReagent 购于Invitrogen公司；EASY Spin植物快速提取试剂盒购于北京艾德莱生物科技有限公司。
1.1.2.2 其他试剂。
DEPC 购于Solarbio 公司；Advantage 2 PCR kit 购于Clontech 公司；其他常规生化试剂均为国产分析纯。
1.1.3 供试引物。
SMART ⅣTM Oligonucleotide（12 μmol/L）5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCG GG-3’；CDS Ⅲ/3’ PCR Primer（12 μmol/L）5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d（T）30N-1N-3’。
1.2 方法
1.2.1 豬苓菌核及菌丝体中总RNA提取。
1.2.1.1 Trizol改良法[8]。
取1.5 mL预冷后EP管，分别加入80 mg 经液氮研磨后的猪苓菌核及菌丝体粉末，经1 mL Trizol试剂的裂解后，加入氯仿产生有机相，离心取上清后加入等体积的水饱和酚、三氯甲烷和异戊醇去除蛋白质[9]，离心取上清后用异丙醇沉淀RNA[10]，离心去上清后由75% 乙醇清洗沉淀2～3 次，最后用DEPC水溶解沉淀。
1.2.1.2 试剂盒法。
参照EASY Spin 植物RNA快速提取试剂盒说明书的方法进行操作。
1.2.2 总RNA检测。
用紫外分光光度法检测提取总RNA的均一性；用1%琼脂糖凝胶、TAE缓冲液电泳检测所得总RNA的完整性。
1.2.3 猪苓菌核及菌丝体cDNA的合成。
1.2.3.1 cDNA第一链的合成。
向0.5 mL EP管中加入3 μL 总RNA、1 μL SMART ⅣTM Oligonucleotide、1 μL CDS Ⅲ/3’ PCR Primer，瞬时离心。72 ℃孵育2 min，冰上冷却2 min，瞬时离心。再按顺序加入2 μL 5×FirstStrand Buffer、1 μL DTT（20 mmol/L）、1 μL dNTP Mix（10 mmol/L）、1 μL SMARTScribeTM MMLV Reverse Transcriptase，反应体系为10 μL，轻轻混合。42 ℃水浴1 h，将管置于冰上终止反应。
2 结果与分析
2.1 RNA完整性检测
采用2种提取方法都可以从猪苓菌核和菌丝体中提取出总RNA，由图1和图2的电泳结果可见，都出现了总RNA的28S、18S、5S这3条条带。但是Trizol改良法的5S条带拖尾现象比较严重，说明Trizol改良法提取的总RNA存在着降解问题，可能是RNase酶未去除干净或温度过高导致RNA单链断裂，致使RNA降解；而试剂盒法提取出的RNA，3条带比较清晰，意味着RNA没有出现蛋白质残留或DNA污染等现象，而且28S的亮度约为18S的2倍，表明提取的总RNA完整性很高，没有发生降解。
2.2 RNA均一性检测
用紫外分光光度计测定OD260/280来检验所提取总RNA的均一性，当OD260/280值过小时，表明有蛋白质或酚污染；当OD260/280值大于2.2时，意味着RNA已经降解成单核酸了[10-11]。由表1可知，采用试剂盒法提取总RNA的OD260/280比值均为1.7～2.1，表明总RNA纯度很高；而采用Trizol改良法提取总RNA的OD260/280比值大于22，表明总RNA已经降解。但是，相比Trizol改良法，试剂盒法提取的总RNA产量偏低，推测是样品在用基因组DNA清除柱清除残留DNA时RNA的产量也严重降低。猪苓菌核中的总RNA产量明显低于菌丝体中的总RNA产量，其原因可能是因为菌核处于休眠状态，活性较弱，且菌核细胞趋于木质化，裂解难度增大，导致总RNA产量比较低。
2.3 LD-PCR扩增cDNA
通过对猪苓菌核及菌丝体的cDNA合成和LD-PCR扩增，经电泳检测扩增产物，其结果见图3、4。猪苓菌核和菌丝体的引物扩增条带弥散分别分布在1 000～5 000 bp和750～2 500 bp，说明它们的cDNA扩增带的丰度和长度均符合cDNA文库构建条件。
3 讨论与结论
猪苓菌核细胞内含有较多的多糖和麦角甾醇，而且其含量随年份增加亦明显升高，而用液体发酵培养的菌丝体多糖和麦角甾醇含量更是高于菌核[12]。猪苓菌核是由拟薄壁组织和疏丝组织形成的一种休眠体，是菌核贮藏养分的器官[13]，这些因素都明显增加了猪苓菌核及菌丝体总RNA的提取难度。栾换东等[14]采用Trizol法、Trizol改良1法、Trizol改良2法及CTAB改良法对长白山猪苓菌丝体总RNA的提取结果表明，Trizol法存在多糖多酚污染，影响了RNA的完整性，CTAB改良法耗时较长，产率比较低，Trizol改良1法、Trizol改良2法提取的总RNA无论是完整性还是纯度均较Trizol法与CTAB改良法好。秦亚丽[15]分别采用Trizol试剂法、RNAiso plus法、RNAiso plus搭配RNAisomate for Plant Tissue法、CTABLiCl法及Trizol Reagent法共5种方法对陕西猪苓菌丝体总RNA进行提取，结果表明CTAB法与Trizol Reagent法所提出的RNA产率低，且OD260/280也达不到要求；Trizol法与RNAiso plus法虽得出了明显的条带，但存在蛋白质或多糖污染，而RNAiso plus搭配RNAisomate for Plant Tissue法经改良后得到的RNA质量和产量都很好。 鉴于猪苓菌核特殊的结构和在提取总RNA时出现的困难，笔者认为需要注意以下几点：①加入裂解液前要保证猪苓样品一直处于冷冻的状态；②针对猪苓菌核难提取易降解的情况，可适当增加裂解液的量并延长裂解液与猪苓样品接触的时间；③用提前预热到75～85 ℃的RNasefree H2O溶解RNA，这些可以在一定程度上提高总RNA产量。
该研究采用了Trizol改良法和试剂盒法2种不同的方法提取猪苓菌核和菌丝体的总RNA。Trizol试剂作为普遍的RNA提取試剂，虽然成功率高，但所得总RNA纯度较低，完整性较差，易降解；而试剂盒法比较简便，且提取时间短，通常30 min就可以完成，所得RNA纯度比较高，完整性也较好。
参考文献
[1] 姜静.分子生物学实验原理与技术[M].哈尔滨：东北林业大学出版社，2003.
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[8] 杨楠，徐正进，周永力.改良TRIZOL法提取高质量稻曲病菌总RNA的方法[J].现代农业科技，2008（11）：145-149.
[9] 王阿娜，裴瑾，刘薇，等.桑叶片总RNA提取方法的比较研究[J].中成药，2012，34（7）：1377-1380.
[10] 张晓丽，代红军.植物RNA提取方法的研究进展[J].北方园艺，2014（8）：175-178.
[11]汪天虹.分子生物学实验[M].北京：北京大学出版社，2008：36.
[12] 李雯瑞，梁宗锁，陈德育，等.不同发育阶段猪苓菌核显微结构和成分含量的比较[J].西北林学院学报，2013，28（4）：116-121.
[13] 周微微.猪苓菌核及发酵菌丝体化学成分研究及质量分析[D].北京：中国协和医科大学，2008.
[14] 栾换东，战莹莹，姜颖越，等.长白山药用真菌鸡爪苓菌丝体总RNA提取方法的比较[J].延边大学农学学报，2014，36（4）：297-301.
[15] 秦亚丽.猪苓遗传多样性及多糖合成酶-UGPase基因的克隆[D].杨凌：西北农林科技大学，2012.