【摘 要】
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目的 探讨miR-148a-3p调控1型辅助性T(Th1)细胞极化调控的分子机制.方法 分离6周龄小鼠的脾单个核细胞,经免疫磁珠阴性分选获得初始CD4+(na?ve CD4+)Th细胞,用流式细胞术测定na?ve CD4+Th细胞CD62L表达水平.用小鼠白细胞介素12(IL-12)和IL-2及抗小鼠IL-4,CD28和CD3ε单克隆抗体的混合因子体外诱导na?ve CD4+Th细胞向Th1细胞极化,同时在诱导体系中加入miR-148a-3p模拟物,诱导72 h.流式细胞术检测干扰素γ(IFN-γ)和CD
【机 构】
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天津医科大学总医院儿科,天津 300052;军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所,北京 100850;军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所,北京 100850;天津医科大学总医院儿科,天津 300
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目的 探讨miR-148a-3p调控1型辅助性T(Th1)细胞极化调控的分子机制.方法 分离6周龄小鼠的脾单个核细胞,经免疫磁珠阴性分选获得初始CD4+(na?ve CD4+)Th细胞,用流式细胞术测定na?ve CD4+Th细胞CD62L表达水平.用小鼠白细胞介素12(IL-12)和IL-2及抗小鼠IL-4,CD28和CD3ε单克隆抗体的混合因子体外诱导na?ve CD4+Th细胞向Th1细胞极化,同时在诱导体系中加入miR-148a-3p模拟物,诱导72 h.流式细胞术检测干扰素γ(IFN-γ)和CD4双阳性(IFN-γ+CD4+)细胞百分比,实时荧光定量PCR检测Th1细胞极化相关基因IFN-γ、信号转导与转录激活因子1(STAT1)、IL-12受体β1(IL-12Rβ1)、IL-12Rβ2、STAT4和T细胞介导的转录调节因子21(Tbx21)mRNA表达水平;Western印迹法检测Th1细胞极化关键转录因子STAT4和磷酸化STAT4(p?STAT4)蛋白表达水平.经生物信息学分析预测miR-148a-3p对IL-12/IL-12Rβ1/IL-12Rβ2/IFN-γ通路分子IL-12Rβ1,IL-12Rβ2,Tbx21和STAT4的调控靶标序列,用双荧光素酶载体psiCHECK2分别构建IL-12Rβ1,IL-12Rβ2,Tbx21和STAT4的3\'UTR序列(psi-wt)及靶标点突变(psi-mutant)序列的克隆载体.将psi-wt和psi-mutant载体分别与miR-148a-3p模拟物共转染至人宫颈癌HeLa细胞,转染36 h后裂解细胞进行双荧光素酶报告基因检测.结果 经免疫磁珠分选获得的na?ve CD4+Th细胞高表达CD62L,表明na?ve CD4+Th细胞分离成功;诱导后Th1细胞极化百分比为(71±5)％,miR-148a-3p模拟物转染后Th1细胞极化百分比下降至(61±3)％(P<0.05).miR-148a-3p模拟物转染可下调Th1极化关键转录因子STAT1(P<0.01),Tbx21(P<0.01)和STAT4(P<0.01)mRNA表达水平,同时IL-12/IL-12Rβ1/IL-12Rβ2/IFN-γ通路的关键受体IL-12Rβ1(P<0.05)和IL-12Rβ2(P<0.01)及调控Th1极化关键细胞因子IFN-γ(P<0.01)mRNA表达水平亦显著下调.miR-148a-3p模拟物转染可显著下调Th1极化过程所必需的STAT4和p-STAT4蛋白表达水平.生物信息学预测miR-148a-3p靶标并用双荧光素酶报告载体构建含其psi-wt和psi-mutant序列的克隆载体;经双荧光素酶报告系统检测证实,miR-148a-3p可靶向下调IL-12/IL-12Rβ1/IL-12Rβ2/IFN-γ通路的多个关键分子STAT4(P<0.01),Tbx21(P<0.01),IL-12Rβ1(P<0.01)和IL-12Rβ2(P<0.01)表达.结论 miR-148a-3p通过靶向抑制IL-12/IL-12Rβ1/IL-12Rβ2/IFN-γ通路中STAT4,Tbx21,IL-12Rβ1和IL-12Rβ2蛋白表达抑制Th1细胞极化.
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