【摘 要】
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目的:构建pET32a(+)-hDll l(DSL)原核表达载体,表达、纯化hDll l(DSL)蛋白,观察其对脐带血CD34(+)细胞的休外扩增作用.方法:克隆hDll 1(DSL),构建pET32a(+)-hdll1(DSL),重组
【机 构】
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第四军医大学唐都医院,血液科,陕西,西安,710038第四军医大学唐都医院,中医科暨中西医结合肿瘤科,陕西,西安,710038;第四军医大学遗传与发育生物学教研室,陕西,西安,710032;
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目的:构建pET32a(+)-hDll l(DSL)原核表达载体,表达、纯化hDll l(DSL)蛋白,观察其对脐带血CD34(+)细胞的休外扩增作用.方法:克隆hDll 1(DSL),构建pET32a(+)-hdll1(DSL),重组表达载体.转化大肠杆菌BL21,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达,镍珠亲合层析纯化蛋白.重组信号结合蛋白(RBP-J)报告基因实验及Notch下游分子Her1检测证实hDlll(DSL)活性.磁珠分选脐带血CD34+细胞,加入hdll1(DSL)或联合干细胞因子(SCF),FIt3配体(FL)、血小板生成表(TPO)孵育1周,观察体外扩增作用.结果:成功克隆hDlll(DSL),并构建了pET32a(+)- hDll1(DSL)重组表达载体.在大肠杆菌BL21成功表达Trx- hDll1(DSL)融合蛋白,经镍珠亲合层析纯化蛋白,成功获得高纯度的Trx-hDll1(DSL)融合蛋白.配体活性实验显示,可溶性的Trx-hdll1(DSL)蛋白可以激活RBP-J报告墓因,并且能上调Notch下游分子Hes1的表达,证明其能够激活Notch信号通路.此外,Trx-hDll1(DSL)融合蛋白与SCF、FL及TPO联用,具有协同刺激CD34+细胞体外扩增的作用.结论:成功构建了pET32a(+)-hDll1(DSL)重组表达载体,表达、纯化了具有生物学活性的Trx-hDill1(DSL)融合蛋白,具有协同刺激CD34+细胞体外扩增的作用,为造血于/祖细胞体外扩增体系的优化研究奠定了基础.
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