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【摘要】 目的：探讨不同浓度阿仑膦酸钠对人骨髓间充质干细胞体外骨向诱导增殖和成骨诱导分化能力的影响。方法：取生长状态良好的第四代细胞，分为实验组（不同浓度的阿仑膦酸钠，A-F组）、空白对照组（L-DMEM，G组）和阳性对照组（地塞米松，H组）各自诱导成骨分化。观察细胞形态，放射免疫法检测各组hBMSCs骨钙素的分泌能力，实时荧光定量PCR检测各组细胞培养液中Runx2和Osx mRNA的表达情况，并检测经成脂肪细胞诱导分化后细胞内脂蛋白脂酶（LPL）mRNA的表达情况。结果：hBMSCs诱导分化至第7天时，A-F组大部分细胞仍呈长梭形，G组部分细胞开始出现形态学改变；各组细胞培养基中骨钙素均随诱导分化时间推移而增多；各组细胞表达Osx和Runx2 mRNA也随诱导分化时间推移而增多；hBMSCs经诱导分化21 d时，A-F组细胞Osx和Runx2 mRNA表达量进一步增加，E组和F组超过半数细胞阳性表达，高于其他阿伦磷酸钠工作液诱导组；在阴性对照组，始终未见有细胞形态学改变、骨钙素表达和Osx和Runx2 mRNA表达。结论：ALN能促进hBMSCs增殖和骨向分化，1×10-6mol/L为其诱导分化的合适浓度。
【关键词】 阿仑膦酸钠； 人骨髓间充质干细胞； 体外诱导； 骨向分化
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2013.14.075
阿仑膦酸钠可以抑制各种情况下的骨量丢失，包括原发性骨质疏松和肢体制动、双侧卵巢切除术后等各种原因造成的继发性骨质疏松[1-2]，同时可以提高骨生物力学水平。研究发现在组织水平， 阿仑膦酸钠能够降低骨转换，形成钙正平衡，使骨量增加，但其分子机制目前还不十分清楚，一般认为其作用的靶细胞为成熟的破骨细胞[3]，也有人认为阿仑膦酸钠在一定浓度下可影响成骨细胞的增殖，甚至可能促进成骨细胞成熟分化[4-5]，另外不排除在诱导骨髓基质干细胞向成骨细胞分化方面起作用。目前，阿伦磷酸钠对成骨细胞的增殖有不同的研究结果，多数学者认为适宜浓度下阿伦磷酸钠促进成骨细胞的增殖，甚至可能促进成骨细胞增殖或成熟分。但其浓度相关性影响细胞增殖的机制有待进一步研究。笔者就不同浓度的阿仑膦酸钠对人骨髓间充质干细胞体外骨向诱导进行实验，发现了体外培养所需的最适浓度，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 主要试剂、仪器和人骨髓间充质干细胞 所需试剂：L-DMEM（DMEM-低糖培养基， Gibco公司，美国）、胎牛血清（fetal bovin serum，FBS，杭州四季青）、0.25%胰酶/EDTA（杭州）、人淋巴细胞分离液（密度1.077 g/ml，天津市TBD生物中心）、磷酸盐缓冲盐水（PBS，武汉博士德）、青霉素/链霉素双抗（杭州）、CD31、CD45、CD29、CD44小鼠抗人流式抗体（abcam）、FITC标记大鼠抗小鼠二抗（武汉博士德）、IBMX（3-异丁基-1-甲基黄嘌呤）、胰岛素和吲哚美辛均购自Sigma公司；油红O购自Amresco公司；离心管、培养皿和96孔培养板（Corning， 美国）、倒置相差显微镜（德国Leica公司）、C02培养箱（美国Thermo Formo公司）、离心机（Beckman Coulter）、Beckman Coulter流式细胞仪器、超净工作台（苏州净化设备有限公司）、恒温水箱和气浴恒温振荡器（江苏省金坛市荣华仪器制造有限）。
本实验所有标本均取自因骨性关节炎需行全髋关节置换或膝关节表面置换术的患者。同时本研究需排除患有其他骨关节疾病包括类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、系统性红斑狼疮、骨肿瘤、甲状腺和甲状旁腺疾病以及肾功能不全的患者。
1.2 诱导分化步骤 取融合至80%～90%第4代人骨髓间充质干细胞，进行分孔成骨诱导分化。每个96孔板分为8个组（A-H组，每组12孔），每个孔加入不同浓度的阿伦磷酸钠工作液（购于石家庄制药集团有限公司），浓度分别为1×10-10、1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5 mol/L（分别为A-F组），同时设立空白对照组和阳性对照组，分别加入等体积不含阿伦磷酸钠工作液的L-DMEM作为阴性对照组（G组），和加入含浓度为1×10-8 mol/L的地塞米松诱导液作为阳性对照组（H组）。将3个96孔板置于37 ℃、5%CO2的孵育箱内培养。3个96孔板细胞分别进行成骨诱导时间为7、14和21 d，诱导分化期间每2天换液1次。
1.3 人骨髓间充质干细胞体外诱导向成骨分化的鉴定 人骨髓间充质干细胞体外诱导向成骨分化第7、14和21天时，分别进行放射免疫法对细胞培养液中骨钙素分泌能力进行检测和采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测诱导分化后的人骨髓间充质干细胞Runx2和Osx mRNA的表达情况，同时采用qRT-PCR检测经成脂肪细胞诱导分化后细胞内脂蛋白脂酶（LPL）mRNA的表达情况。
1.4 人骨髓间充质干细胞体外诱导向成骨分化细胞形态变化 人骨髓间充质干细胞进行诱导成骨分化后，每2天显微镜下观察一次细胞形态改变情况，同时观察细胞生长、成骨分化情况。
1.5 放射免疫法检测细胞培养基中骨钙素含量 骨钙素放射免疫试剂盒购于中国原子能科学研究院。放射免疫仪型号为：Fj-2008全自动免疫计数仪（西安262厂生产）。放射免疫法的具体步骤参照试剂盒说明书。将成骨诱导分化7、14和21 d后的细胞培养基进行收集，分析培养基中骨钙素的含量。
1.6 qRT-PCR检测诱导分化细胞的LPL、Runx2、Osx、β-actin表达 通过以下五步骤进行操作：（1）引物设计合成；（2）细胞总RNA的提取；（3）逆转录反应；（4）荧光定量PCR反应；（5） LPL、Osx和Runx2 mRNA表达量分析。
1.7 统计学处理 采用 SPSS 13.0软件进行统计分析，计量资料以（x±s）表示，采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果
2.1 细胞诱导成骨分化形态改变 到第7天时，A-F组阿伦膦酸钠工作液诱导组大部分细胞仍呈长梭形，只有小部分细胞见形态发生变化，空白对照细胞形态无明显变化（图1）。诱导分化至第14天时，阿伦膦酸钠工作液组更多细胞形态出现改变，与诱导分化至第7天时比较，较多细胞由长梭形开始向圆形转变，但细胞数量仍较少，各组细胞形态都在不同程度改变，在E组和F组，细胞形态改变较明显。空白对照细胞仍无明显变化。在地塞米松诱导分化组，细胞大多呈圆形并可见反光（图2）。细胞诱导分化至第21天时，A-F组细胞诱导分化改变有所提高，尤其在E组和F组，与A-D组相比，较多细胞向成骨分化，在显微镜下观察可见较多细胞有反光。在地塞米松诱导分化组细胞呈圆形，显微镜下观察大部分细胞可见反光（图3）。
图1 第7天各组细胞形态
注：A-F组大部分细胞仍呈长梭形，G组细胞形态无明显变化
图2 第14天各组细胞形态
注：A-F组更多细胞形态出现改变
图3 第21天各组细胞形态
注：A-F组细胞诱导分化改变有所提高
2.2 放射免疫法检测细胞培养基中骨钙素含量 细胞诱导分化至第7、14和21天时，A-F组培养基中骨钙素含量见表1，而骨钙素含量有随细胞成骨诱导分化而增加趋势。
表1 各组培养基中骨钙素含量 ng/ml
组别 诱导分化时间
第7天 第14天 第21天
A组
B组
C组
D组
E组
F组
H组 0.03±0.01*△#
0.03±0.02*△#
0.05±0.02*△#
0.05±0.02*△#
0.06±0.01*
0.08±0.02*
0.14±0.06 0.17±0.04*△#
0.19±0.05*△#
0.20±0.04*△#
0.21±0.05*△#
0.27±0.09*
0.28±0.08*
0.46±0.13 0.24±0.06*△#
0.25±0.05*△#
0.26±0.05*△#
0.27±0.06*△#
0.46±0.07*
0.52±0.06*
0.82±0.09
注：G组为空白对照组未能检出骨钙素，故表中未列G组；*与同一时间点H组比较，P<0.05；△与同一时间点E组比较，P<0.05；#与同一时间点F组比较，P<0.05
2.3 qRT-PCR检测诱导分化细胞LPL、Runx2、Osx的表达见表2。
3 讨论
目前关于阿仑膦酸钠在诱导BMSCs成骨分化的确切作用机制仍不清楚。文献报道阿仑膦酸钠对破骨细胞的作用可能通过以下作用机制：（1）阿仑膦酸钠可有力吸附在骨的表面，阻止膦酸盐晶体的生长和溶解，同时改变了骨基质蛋白的特性，防止破骨细胞进行黏附。（2）阿仑膦酸钠与骨结合后，一旦被破骨细胞酸化诱导，便在吸收位点局部释放出来，干扰破骨细胞膜的完整性，使破骨细胞对一些小离子的通透性增加。同时在骨表面维持足够的浓度梯度抑制破骨细胞活化的过程并抑制其泌酸过程。（3）阿仑膦酸钠也可能作用于成骨细胞或BMSCs，间接抑制成熟破骨细胞的功能或抑制破骨细胞前提的增殖或分化，甚至有些学者认为阿仑膦酸钠并非直接作用于破骨细胞[6]，而是通过成骨细胞介导抑制破骨细胞活性，从而抑制骨吸收。Fabian等[7]经过体外实验证明阿仑膦酸钠有促进BMSCs增殖和向成骨细胞分化的作用。蒋四清等[8]证明1×10-8 mol/L的阿仑膦酸钠对成骨细胞有较强的增殖作用。成骨细胞的来源之一就是由BMSCs分化而来，而目前关于阿仑膦酸钠对BMSCs成骨诱导分化的研究较少。
本研究发现，阿仑膦酸钠诱导分化BMSCs到第7天时，较少细胞向成骨分化，主要表现在细胞形态改变不明显，培养基中骨钙素表达量低，同时qRT-PCR检测成骨相关标志物Osx和Runx2 mRNA在不同浓度组间表达量均较低且组间无明显差别，而在地塞米松诱导分化组，一部分BMSCs已开始向成骨分化。诱导分化至第14天时，阿仑膦酸钠诱导组的细胞成骨分化较第7天时有所提高，尤其在E和F两个剂量较高组，细胞形态向成骨转化增加，同时培养基中骨钙素以及细胞中Osx和Runx2的mRNA表达量也相应升高，与A-D较低浓度组相比，差异具有统计学意义，说明较高浓度阿仑膦酸钠组在诱导BMSCs向成骨分化至第14天时，已开始进入迅速诱导分化期。诱导分化至第21天时，在E和F组大多数细胞经细胞形态学、骨钙素表达量和qRT-PCR证实向成骨转化，在A-D组诱导分化也有所提高，提高相对较小。而在阴性对照组始终未见细胞改变。本研究证明1×10-6和1×10-5 mol/L浓度的阿仑膦酸钠诱导液诱导BMSCs成骨分化至14 d时，已开始进入迅速分化期，诱导至21 d时成骨分化明显比其他低浓度组好，而在E和F两组间诱导分化差别不大，故笔者认为1×10-6 mol/L浓度的阿仑膦酸钠诱导液具有较好的诱导效率，虽然本研究只诱导分化了21 d，但已有半数以上的细胞向成骨分化，故推测随着时间的延长将可能有更多细胞向成骨分化。
本研究初步证明，低浓度的阿仑膦酸钠具有较好的诱导效应，在临床工作中，长期使用低浓度阿仑膦酸钠将可以使从骨髓动员的BMSCs成骨分化率增加。笔者认为1×10-6 mol/L浓度的阿仑膦酸钠诱导BMSCs成骨分化至21 d已可以取得较好的效果，从而可为下一步研究阿仑膦酸钠诱导BMSCs成骨分化的分子生物学机制提供基础。 参考文献
[1] Delmas P D.Treatment of postmenopausal osteoporosis[J].Lancet，2002，359（9322）：2018.
[2] Sambrook P N.Glucocorticoid osteoporosis[J].Curr Pharm Des，2002， 54（21）：1877.
[3] Russell R G， Rogers M J.Bisphosphonates： from the laboratory to the clinic and back again[J].Bone，1999，25（4）：97-106.
[4] Img I，Qurshi S A，Kenney J，et al. Osteoblast proliferation and maturation by bisphosphonates[J].Biomaterials， 2004，25（18）：4105-4115.
[5] Reinholz G G， Getz B， Pedersonl， et al. Bisphosphonates directly regulate cell proliferation， differentiation， and gene expression in human osteoblasts [J].Cancer Res，2000，60（45）：6001-6007.
[6]郭世妭.骨质疏松症的药物治疗及其理论基础[J].中华骨科杂志，2004，24（11）：691-695.
[7] Fabian K， Claude J， Marc K， et al. Effects of bisphosphonates on proliferation and osteoblast differentiation of human bone marrow stromal cells[J].J Biomaterials，2005，26（20）：6941-6949.
[8]蒋四清，李锋.阿仑膦酸钠对大鼠成骨细胞增殖的影响[J].中国矫形外科杂志，2005，13（12）：918-920.
（收稿日期：2012-12-12） （本文编辑：陈丹云）
【关键词】 阿仑膦酸钠； 人骨髓间充质干细胞； 体外诱导； 骨向分化
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2013.14.075
阿仑膦酸钠可以抑制各种情况下的骨量丢失，包括原发性骨质疏松和肢体制动、双侧卵巢切除术后等各种原因造成的继发性骨质疏松[1-2]，同时可以提高骨生物力学水平。研究发现在组织水平， 阿仑膦酸钠能够降低骨转换，形成钙正平衡，使骨量增加，但其分子机制目前还不十分清楚，一般认为其作用的靶细胞为成熟的破骨细胞[3]，也有人认为阿仑膦酸钠在一定浓度下可影响成骨细胞的增殖，甚至可能促进成骨细胞成熟分化[4-5]，另外不排除在诱导骨髓基质干细胞向成骨细胞分化方面起作用。目前，阿伦磷酸钠对成骨细胞的增殖有不同的研究结果，多数学者认为适宜浓度下阿伦磷酸钠促进成骨细胞的增殖，甚至可能促进成骨细胞增殖或成熟分。但其浓度相关性影响细胞增殖的机制有待进一步研究。笔者就不同浓度的阿仑膦酸钠对人骨髓间充质干细胞体外骨向诱导进行实验，发现了体外培养所需的最适浓度，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 主要试剂、仪器和人骨髓间充质干细胞 所需试剂：L-DMEM（DMEM-低糖培养基， Gibco公司，美国）、胎牛血清（fetal bovin serum，FBS，杭州四季青）、0.25%胰酶/EDTA（杭州）、人淋巴细胞分离液（密度1.077 g/ml，天津市TBD生物中心）、磷酸盐缓冲盐水（PBS，武汉博士德）、青霉素/链霉素双抗（杭州）、CD31、CD45、CD29、CD44小鼠抗人流式抗体（abcam）、FITC标记大鼠抗小鼠二抗（武汉博士德）、IBMX（3-异丁基-1-甲基黄嘌呤）、胰岛素和吲哚美辛均购自Sigma公司；油红O购自Amresco公司；离心管、培养皿和96孔培养板（Corning， 美国）、倒置相差显微镜（德国Leica公司）、C02培养箱（美国Thermo Formo公司）、离心机（Beckman Coulter）、Beckman Coulter流式细胞仪器、超净工作台（苏州净化设备有限公司）、恒温水箱和气浴恒温振荡器（江苏省金坛市荣华仪器制造有限）。
本实验所有标本均取自因骨性关节炎需行全髋关节置换或膝关节表面置换术的患者。同时本研究需排除患有其他骨关节疾病包括类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、系统性红斑狼疮、骨肿瘤、甲状腺和甲状旁腺疾病以及肾功能不全的患者。
1.2 诱导分化步骤 取融合至80%～90%第4代人骨髓间充质干细胞，进行分孔成骨诱导分化。每个96孔板分为8个组（A-H组，每组12孔），每个孔加入不同浓度的阿伦磷酸钠工作液（购于石家庄制药集团有限公司），浓度分别为1×10-10、1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5 mol/L（分别为A-F组），同时设立空白对照组和阳性对照组，分别加入等体积不含阿伦磷酸钠工作液的L-DMEM作为阴性对照组（G组），和加入含浓度为1×10-8 mol/L的地塞米松诱导液作为阳性对照组（H组）。将3个96孔板置于37 ℃、5%CO2的孵育箱内培养。3个96孔板细胞分别进行成骨诱导时间为7、14和21 d，诱导分化期间每2天换液1次。
1.3 人骨髓间充质干细胞体外诱导向成骨分化的鉴定 人骨髓间充质干细胞体外诱导向成骨分化第7、14和21天时，分别进行放射免疫法对细胞培养液中骨钙素分泌能力进行检测和采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测诱导分化后的人骨髓间充质干细胞Runx2和Osx mRNA的表达情况，同时采用qRT-PCR检测经成脂肪细胞诱导分化后细胞内脂蛋白脂酶（LPL）mRNA的表达情况。
1.4 人骨髓间充质干细胞体外诱导向成骨分化细胞形态变化 人骨髓间充质干细胞进行诱导成骨分化后，每2天显微镜下观察一次细胞形态改变情况，同时观察细胞生长、成骨分化情况。
1.5 放射免疫法检测细胞培养基中骨钙素含量 骨钙素放射免疫试剂盒购于中国原子能科学研究院。放射免疫仪型号为：Fj-2008全自动免疫计数仪（西安262厂生产）。放射免疫法的具体步骤参照试剂盒说明书。将成骨诱导分化7、14和21 d后的细胞培养基进行收集，分析培养基中骨钙素的含量。
1.6 qRT-PCR检测诱导分化细胞的LPL、Runx2、Osx、β-actin表达 通过以下五步骤进行操作：（1）引物设计合成；（2）细胞总RNA的提取；（3）逆转录反应；（4）荧光定量PCR反应；（5） LPL、Osx和Runx2 mRNA表达量分析。
1.7 统计学处理 采用 SPSS 13.0软件进行统计分析，计量资料以（x±s）表示，采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果
2.1 细胞诱导成骨分化形态改变 到第7天时，A-F组阿伦膦酸钠工作液诱导组大部分细胞仍呈长梭形，只有小部分细胞见形态发生变化，空白对照细胞形态无明显变化（图1）。诱导分化至第14天时，阿伦膦酸钠工作液组更多细胞形态出现改变，与诱导分化至第7天时比较，较多细胞由长梭形开始向圆形转变，但细胞数量仍较少，各组细胞形态都在不同程度改变，在E组和F组，细胞形态改变较明显。空白对照细胞仍无明显变化。在地塞米松诱导分化组，细胞大多呈圆形并可见反光（图2）。细胞诱导分化至第21天时，A-F组细胞诱导分化改变有所提高，尤其在E组和F组，与A-D组相比，较多细胞向成骨分化，在显微镜下观察可见较多细胞有反光。在地塞米松诱导分化组细胞呈圆形，显微镜下观察大部分细胞可见反光（图3）。
图1 第7天各组细胞形态
注：A-F组大部分细胞仍呈长梭形，G组细胞形态无明显变化
图2 第14天各组细胞形态
注：A-F组更多细胞形态出现改变
图3 第21天各组细胞形态
注：A-F组细胞诱导分化改变有所提高
2.2 放射免疫法检测细胞培养基中骨钙素含量 细胞诱导分化至第7、14和21天时，A-F组培养基中骨钙素含量见表1，而骨钙素含量有随细胞成骨诱导分化而增加趋势。
表1 各组培养基中骨钙素含量 ng/ml
组别 诱导分化时间
第7天 第14天 第21天
A组
B组
C组
D组
E组
F组
H组 0.03±0.01*△#
0.03±0.02*△#
0.05±0.02*△#
0.05±0.02*△#
0.06±0.01*
0.08±0.02*
0.14±0.06 0.17±0.04*△#
0.19±0.05*△#
0.20±0.04*△#
0.21±0.05*△#
0.27±0.09*
0.28±0.08*
0.46±0.13 0.24±0.06*△#
0.25±0.05*△#
0.26±0.05*△#
0.27±0.06*△#
0.46±0.07*
0.52±0.06*
0.82±0.09
注：G组为空白对照组未能检出骨钙素，故表中未列G组；*与同一时间点H组比较，P<0.05；△与同一时间点E组比较，P<0.05；#与同一时间点F组比较，P<0.05
2.3 qRT-PCR检测诱导分化细胞LPL、Runx2、Osx的表达见表2。
3 讨论
目前关于阿仑膦酸钠在诱导BMSCs成骨分化的确切作用机制仍不清楚。文献报道阿仑膦酸钠对破骨细胞的作用可能通过以下作用机制：（1）阿仑膦酸钠可有力吸附在骨的表面，阻止膦酸盐晶体的生长和溶解，同时改变了骨基质蛋白的特性，防止破骨细胞进行黏附。（2）阿仑膦酸钠与骨结合后，一旦被破骨细胞酸化诱导，便在吸收位点局部释放出来，干扰破骨细胞膜的完整性，使破骨细胞对一些小离子的通透性增加。同时在骨表面维持足够的浓度梯度抑制破骨细胞活化的过程并抑制其泌酸过程。（3）阿仑膦酸钠也可能作用于成骨细胞或BMSCs，间接抑制成熟破骨细胞的功能或抑制破骨细胞前提的增殖或分化，甚至有些学者认为阿仑膦酸钠并非直接作用于破骨细胞[6]，而是通过成骨细胞介导抑制破骨细胞活性，从而抑制骨吸收。Fabian等[7]经过体外实验证明阿仑膦酸钠有促进BMSCs增殖和向成骨细胞分化的作用。蒋四清等[8]证明1×10-8 mol/L的阿仑膦酸钠对成骨细胞有较强的增殖作用。成骨细胞的来源之一就是由BMSCs分化而来，而目前关于阿仑膦酸钠对BMSCs成骨诱导分化的研究较少。
本研究发现，阿仑膦酸钠诱导分化BMSCs到第7天时，较少细胞向成骨分化，主要表现在细胞形态改变不明显，培养基中骨钙素表达量低，同时qRT-PCR检测成骨相关标志物Osx和Runx2 mRNA在不同浓度组间表达量均较低且组间无明显差别，而在地塞米松诱导分化组，一部分BMSCs已开始向成骨分化。诱导分化至第14天时，阿仑膦酸钠诱导组的细胞成骨分化较第7天时有所提高，尤其在E和F两个剂量较高组，细胞形态向成骨转化增加，同时培养基中骨钙素以及细胞中Osx和Runx2的mRNA表达量也相应升高，与A-D较低浓度组相比，差异具有统计学意义，说明较高浓度阿仑膦酸钠组在诱导BMSCs向成骨分化至第14天时，已开始进入迅速诱导分化期。诱导分化至第21天时，在E和F组大多数细胞经细胞形态学、骨钙素表达量和qRT-PCR证实向成骨转化，在A-D组诱导分化也有所提高，提高相对较小。而在阴性对照组始终未见细胞改变。本研究证明1×10-6和1×10-5 mol/L浓度的阿仑膦酸钠诱导液诱导BMSCs成骨分化至14 d时，已开始进入迅速分化期，诱导至21 d时成骨分化明显比其他低浓度组好，而在E和F两组间诱导分化差别不大，故笔者认为1×10-6 mol/L浓度的阿仑膦酸钠诱导液具有较好的诱导效率，虽然本研究只诱导分化了21 d，但已有半数以上的细胞向成骨分化，故推测随着时间的延长将可能有更多细胞向成骨分化。
本研究初步证明，低浓度的阿仑膦酸钠具有较好的诱导效应，在临床工作中，长期使用低浓度阿仑膦酸钠将可以使从骨髓动员的BMSCs成骨分化率增加。笔者认为1×10-6 mol/L浓度的阿仑膦酸钠诱导BMSCs成骨分化至21 d已可以取得较好的效果，从而可为下一步研究阿仑膦酸钠诱导BMSCs成骨分化的分子生物学机制提供基础。 参考文献
[1] Delmas P D.Treatment of postmenopausal osteoporosis[J].Lancet，2002，359（9322）：2018.
[2] Sambrook P N.Glucocorticoid osteoporosis[J].Curr Pharm Des，2002， 54（21）：1877.
[3] Russell R G， Rogers M J.Bisphosphonates： from the laboratory to the clinic and back again[J].Bone，1999，25（4）：97-106.
[4] Img I，Qurshi S A，Kenney J，et al. Osteoblast proliferation and maturation by bisphosphonates[J].Biomaterials， 2004，25（18）：4105-4115.
[5] Reinholz G G， Getz B， Pedersonl， et al. Bisphosphonates directly regulate cell proliferation， differentiation， and gene expression in human osteoblasts [J].Cancer Res，2000，60（45）：6001-6007.
[6]郭世妭.骨质疏松症的药物治疗及其理论基础[J].中华骨科杂志，2004，24（11）：691-695.
[7] Fabian K， Claude J， Marc K， et al. Effects of bisphosphonates on proliferation and osteoblast differentiation of human bone marrow stromal cells[J].J Biomaterials，2005，26（20）：6941-6949.
[8]蒋四清，李锋.阿仑膦酸钠对大鼠成骨细胞增殖的影响[J].中国矫形外科杂志，2005，13（12）：918-920.
（收稿日期：2012-12-12） （本文编辑：陈丹云）