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摘要 [目的] 研究GABA对高温下酸枣种子发芽的影响。[方法]采用不同的抑制剂对酸枣种子进行处理，研究GABA对酸枣种子在高温下发芽的促进作用。[结果]GABA能显著提高酸枣种子在高温（40 ℃）下发芽率。此外，H2O2、DMTU、DPI、ABA和fluridone能显著促进GABA在高温下对种子发芽的影响。[结论]GABA能促进种子高温下发芽，可能与其诱导种子中H2O2降解ABA有关。
关键词 γ-氨基丁酸;高温;酸枣种子;双氧水
中图分类号 S665.1文献标识码 A文章编号 0517-6611（2020）07-0054-02
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.07.017
Effects of GABA on Jujube Seed Germination under High Temperature
DENG Benliang， ZHAO Xusheng
（Luoyang Normal University， Luoyang， Henan 471934）
Abstract [Objective] To study the effect of GABA on jujube seed germination under high temperature stress.[Method] Different specific inhibitors were applied on heat stressed jujube seeds and the effects were investigated by monitoring the germination rate. [Result] GABA could improve jujube seed germination under high temperature and this effect could be significantly modified by H2O2， DMTU， DPI， ABA and fluridone. [Conclusion] GABA could improve seed germination under high temperature. The NADPH oxidase mediated H2O2 was closely associated with the thermodormancy release by GABA in jujube seed.
Key words γaminobutyric acid;High temperature;Jujube seed;Hydrogen peroxide
作者簡介 邓本良（1978—），男，湖南洞口人，讲师，博士，从事活性氧调控作物种子发芽机理研究。
收稿日期 2019-07-13;修回日期 2019-07-24
伽马氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一种非蛋白氨基酸，具有多种生理功能，广泛分布于动植物体内。GABA在医学上具有镇静神经、降低血压、降低血氨、促进脑活力等作用[1]。近年来，在植物生长发育和抗逆上有广泛研究[2]。此外，在植物种子发芽过程中会大量合成GABA[3]。
植物种子发芽除需要充足的空气外，还需要适宜的温度及适量的水分。然而，种子在某些逆境（如高温，盐害，重金属污染等）下，轻则降低发芽能力，重则根本无法发芽出苗[4-8]。此外，很多作物种子的发芽快慢还与种子本身抗氧化物质含量甚至种子本身老化程度等有密切关系[9-11]。
种子发芽过程中，线粒体呼吸作用极其旺盛。在这个过程中，不可避免地会产生大量活性氧[12]。在种子发芽过程中，线粒体和位于胞质空间的NADPH氧化酶是2个产活性氧的主要部位[12]。活性氧浓度过高或过低均会抑制种子发芽[12]。当活性氧含量过高时，植物会被一些抗氧化物质如抗坏血酸和谷胱甘肽清除，从而维持在适宜水平。此外，种子发芽需要降低细胞中脱落酸（ABA）含量。然而，某些逆境胁迫如干旱、高温和盐害能促进种子合成更多ABA，从而阻止发芽进程。但活性氧如H2O2能降解ABA，从而打破种子休眠进入发芽阶段[13]。 二甲基硫脲（dimethylthiourea，DMTU）是一种人工合成的活性氧特异性清除剂，被广泛应用于活性氧研究。此外，二联苯碘（diphenyleneiodonium，DPI）是NADPH氧化酶的一种特异性抑制剂。而氟啶酮（fluridone，缩写为Flu）是ABA合成过程中的特异性抑制剂。笔者利用酸枣种子为试验材料，研究其高温下发芽机理。
1 材料与方法
1.1 试验材料
以购买的酸枣种子为试验材料。酸枣外面的果肉、核壳已去掉，只保留里面的酸枣仁种子。
1.2 试验方法
将酸枣种子先用自来水浸泡12 h，然后转入垫有双层滤纸的玻璃培养皿中。分成以下8组：常温水对照组、高温水对照组、高温GABA处理组、高温GABA加H2O2组、高温GABA加DMTU组、高温GABA加DPI组、高温GABA加ABA组以及高温加Fluridone组。以上几种试剂所用浓度：1 mmol/L GABA，100 mmol/L H2O2，10 mmol/L DMTU，0.1 mmol/L DPI，0.1 mmol/L ABA 以及 1 mmol/L fluridone。常温设定为25 ℃，高温设定为45 ℃。每天分2次检查种子发芽情况，连续检查7 d。当露白0.5 mm即视为发芽。每个试验设定3个重复。
1.3 数据分析
试验数据采用SPSS软件用Duncan’s多重比较进行分析，并用Photoshop软件作图。
2 结果与分析
相对于常温下酸枣发芽率（约70%），高温能显著降低其最终发芽率（第5天）80%左右（约15%）。然而对高温下酸枣种子喷洒1 mmol/L GABA，可以显著提高发芽率至40%，约提高166%（相对于高温水对照）。而喷洒100 mmol/L H2O2，可以进一步提高GABA的促进效果，约在GABA的基础上提升18%左右。相对于H2O2，10 mmol/L DMTU喷洒能削弱GABA在高温下的促进作用，导致发芽率下降约37%。噴洒0.1 mmol/L DPI能削弱GABA在高温下的促进作用，发芽率约降低47%。此外，喷洒0.1 mmol/L ABA，也能显著降低GABA在高温下的保护作用，约降低发芽率27%。然而，喷洒1 mmol/L fluridone（Flu）能显著进一步促进GABA在高温下的保护作用，约提高酸枣种子发芽率35%（图1）。
3 结论与讨论
酸枣种子如果带壳发芽极其缓慢，该试验中选用的是去壳的种子进行试验，约在7 d内能大部分发芽，发芽率高达70%左右。然而高温能显著降低其发芽率，这可能与高温诱导种子中ABA积累有关，导致种子无法打破热休眠进入发芽状态。然而通过喷洒1 mmol/L GABA溶液，可以显著提高酸枣种子在高温下发芽率。推测这种非蛋白氨基酸可能作为异源物（xenobiotic）通过刺激酸枣种子细胞产生活性氧从而协助种子降解ABA。通过喷洒H2O2发现有类似效果，而喷洒H2O2清除剂DMTU会减轻这种效果。这与前人在玉米种子发芽上研究结论类似[4-5]。而作为异源物，最先接触细胞并刺激产活性氧的部位可能是位于细胞膜上的NADPH氧化酶，因此用该酶特异性抑制剂DPI处理后，通过降低该酶活性氧的产生，发现可以显著削弱GABA的刺激作用。这也与在玉米上的处理结果类似[6-7]。最终，使用ABA和其合成特异性抑制剂fluridone对高温下酸枣种子处理后，发现能削弱或促进GABA在高温下的保护作用，这说明GABA对高温下酸枣种子发芽的保护作用与通过产生的活性氧降解高温诱导的脱落酸有关。当然，对于GABA在高温下如何调控酸枣种子的具体机理还需要从生化和分子水平进一步研究。
该研究从表型上确定了GABA对高温下酸枣种子发芽
有显著的保护作用，并对其保护机理进行了初步探讨，为今后从活性氧角度研究如何调控酸枣种子发芽提供了理论基础[12-13]。
参考文献
[1] DIANA M，QULEZ J，RAFECAS M.Gammaaminobutyric acid as a bioactive compound in foods：A review[J].Journal of functional foods，2014，10：407-420.
[2] BOWN A W，SHELP B J.Plant GABA：Not just a metabolite[J].Trends in plant science，2016，21（10）：811-813.
[3] YANG R Q，GUO Q H，GU Z X.GABA shunt and polyamine degradation pathway on γaminobutyric acid accumulation in germinating fava bean（Vicia faba L.）under hypoxia[J].Food chemistry，2013，136（1）：152-159. [4] DENG B L，YANG K J，ZHANG Y F，et al.The effects of temperature on the germination behavior of white，yellow，red and purple maize plant seeds[J].Acta physiologiae plantarum，2015，37（8）：174-184.
[5] DENG B L，YANG K J，ZHANG Y F，et al.Can heavy metal pollution defend seed germination against heat stress Effect of heavy metals（Cu2+，Cd2+ and Hg2+）on maize seed germination under high temperature[J].Environmental pollution，2016，216：46-52.
[6] ZHANG Y F，DENG B L，LI Z T.Inhibition of NADPH oxidase increases defense enzyme activities and improves maize seed germination under Pb stress[J].Ecotoxicology and environmental safety，2018，158：187-192.
[7] ZHANG Y F，SHI H J，DENG B L.Mutageninduced phytotoxicity in maize seed germination is dependent on ROS scavenging capacity[J].Scientific reports，2018，8（1）：14078.
[8] YANG K J，ZHANG Y F，ZHU L H，et al.Omethoate treatment mitigates high salt stress inhibited maize seed germination[J].Pesticide biochemistry and physiology，2018，144：79-82.
[9] DENG B L，ZHANG Y F，YANG K J，et al.Changes in nonenzymatic antioxidant capacity and lipid peroxidation during germination of white，yellow and purple maize seeds[J].Pak J Bot，2016，48（2）：607-612.
[10] DENG B L，ZHANG Y F，YANG K J，et al.The differential antioxidant capacity of watermelon flesh at different maturity stages and its inhibitory effects on seed aging may explain the significance of fruit flesh colors[J].Acta physiologiae plantarum，2017，39（6）：139-145.
[11] DENG B L，YANG K J，ZHANG Y F，et al.Can antioxidant’s reactive oxygen species（ROS）scavenging capacity contribute to aged seed recovery？ Contrasting effect of melatonin，ascorbate and glutathione on germination ability of aged maize seeds[J].Free radical research，2017，51（9/10）：765-771.
[12] JEEVAN KUMAR S P，RAJENDRA PRASAD S，BANERJEE R，et al.Seed birth to death：Dual functions of reactive oxygen species in seed physiology[J].Annals of botany，2015，116（4）：663-668.
[13] LIU Y G，YE N H，LIU R，et al.H2O2 mediates the regulation of ABA catabolism and GA biosynthesis in Arabidopsis seed dormancy and germination[J].Journal of experimental botany，2010，61（11）：2979-2990.
关键词 γ-氨基丁酸;高温;酸枣种子;双氧水
中图分类号 S665.1文献标识码 A文章编号 0517-6611（2020）07-0054-02
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.07.017
Effects of GABA on Jujube Seed Germination under High Temperature
DENG Benliang， ZHAO Xusheng
（Luoyang Normal University， Luoyang， Henan 471934）
Abstract [Objective] To study the effect of GABA on jujube seed germination under high temperature stress.[Method] Different specific inhibitors were applied on heat stressed jujube seeds and the effects were investigated by monitoring the germination rate. [Result] GABA could improve jujube seed germination under high temperature and this effect could be significantly modified by H2O2， DMTU， DPI， ABA and fluridone. [Conclusion] GABA could improve seed germination under high temperature. The NADPH oxidase mediated H2O2 was closely associated with the thermodormancy release by GABA in jujube seed.
Key words γaminobutyric acid;High temperature;Jujube seed;Hydrogen peroxide
作者簡介 邓本良（1978—），男，湖南洞口人，讲师，博士，从事活性氧调控作物种子发芽机理研究。
收稿日期 2019-07-13;修回日期 2019-07-24
伽马氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一种非蛋白氨基酸，具有多种生理功能，广泛分布于动植物体内。GABA在医学上具有镇静神经、降低血压、降低血氨、促进脑活力等作用[1]。近年来，在植物生长发育和抗逆上有广泛研究[2]。此外，在植物种子发芽过程中会大量合成GABA[3]。
植物种子发芽除需要充足的空气外，还需要适宜的温度及适量的水分。然而，种子在某些逆境（如高温，盐害，重金属污染等）下，轻则降低发芽能力，重则根本无法发芽出苗[4-8]。此外，很多作物种子的发芽快慢还与种子本身抗氧化物质含量甚至种子本身老化程度等有密切关系[9-11]。
种子发芽过程中，线粒体呼吸作用极其旺盛。在这个过程中，不可避免地会产生大量活性氧[12]。在种子发芽过程中，线粒体和位于胞质空间的NADPH氧化酶是2个产活性氧的主要部位[12]。活性氧浓度过高或过低均会抑制种子发芽[12]。当活性氧含量过高时，植物会被一些抗氧化物质如抗坏血酸和谷胱甘肽清除，从而维持在适宜水平。此外，种子发芽需要降低细胞中脱落酸（ABA）含量。然而，某些逆境胁迫如干旱、高温和盐害能促进种子合成更多ABA，从而阻止发芽进程。但活性氧如H2O2能降解ABA，从而打破种子休眠进入发芽阶段[13]。 二甲基硫脲（dimethylthiourea，DMTU）是一种人工合成的活性氧特异性清除剂，被广泛应用于活性氧研究。此外，二联苯碘（diphenyleneiodonium，DPI）是NADPH氧化酶的一种特异性抑制剂。而氟啶酮（fluridone，缩写为Flu）是ABA合成过程中的特异性抑制剂。笔者利用酸枣种子为试验材料，研究其高温下发芽机理。
1 材料与方法
1.1 试验材料
以购买的酸枣种子为试验材料。酸枣外面的果肉、核壳已去掉，只保留里面的酸枣仁种子。
1.2 试验方法
将酸枣种子先用自来水浸泡12 h，然后转入垫有双层滤纸的玻璃培养皿中。分成以下8组：常温水对照组、高温水对照组、高温GABA处理组、高温GABA加H2O2组、高温GABA加DMTU组、高温GABA加DPI组、高温GABA加ABA组以及高温加Fluridone组。以上几种试剂所用浓度：1 mmol/L GABA，100 mmol/L H2O2，10 mmol/L DMTU，0.1 mmol/L DPI，0.1 mmol/L ABA 以及 1 mmol/L fluridone。常温设定为25 ℃，高温设定为45 ℃。每天分2次检查种子发芽情况，连续检查7 d。当露白0.5 mm即视为发芽。每个试验设定3个重复。
1.3 数据分析
试验数据采用SPSS软件用Duncan’s多重比较进行分析，并用Photoshop软件作图。
2 结果与分析
相对于常温下酸枣发芽率（约70%），高温能显著降低其最终发芽率（第5天）80%左右（约15%）。然而对高温下酸枣种子喷洒1 mmol/L GABA，可以显著提高发芽率至40%，约提高166%（相对于高温水对照）。而喷洒100 mmol/L H2O2，可以进一步提高GABA的促进效果，约在GABA的基础上提升18%左右。相对于H2O2，10 mmol/L DMTU喷洒能削弱GABA在高温下的促进作用，导致发芽率下降约37%。噴洒0.1 mmol/L DPI能削弱GABA在高温下的促进作用，发芽率约降低47%。此外，喷洒0.1 mmol/L ABA，也能显著降低GABA在高温下的保护作用，约降低发芽率27%。然而，喷洒1 mmol/L fluridone（Flu）能显著进一步促进GABA在高温下的保护作用，约提高酸枣种子发芽率35%（图1）。
3 结论与讨论
酸枣种子如果带壳发芽极其缓慢，该试验中选用的是去壳的种子进行试验，约在7 d内能大部分发芽，发芽率高达70%左右。然而高温能显著降低其发芽率，这可能与高温诱导种子中ABA积累有关，导致种子无法打破热休眠进入发芽状态。然而通过喷洒1 mmol/L GABA溶液，可以显著提高酸枣种子在高温下发芽率。推测这种非蛋白氨基酸可能作为异源物（xenobiotic）通过刺激酸枣种子细胞产生活性氧从而协助种子降解ABA。通过喷洒H2O2发现有类似效果，而喷洒H2O2清除剂DMTU会减轻这种效果。这与前人在玉米种子发芽上研究结论类似[4-5]。而作为异源物，最先接触细胞并刺激产活性氧的部位可能是位于细胞膜上的NADPH氧化酶，因此用该酶特异性抑制剂DPI处理后，通过降低该酶活性氧的产生，发现可以显著削弱GABA的刺激作用。这也与在玉米上的处理结果类似[6-7]。最终，使用ABA和其合成特异性抑制剂fluridone对高温下酸枣种子处理后，发现能削弱或促进GABA在高温下的保护作用，这说明GABA对高温下酸枣种子发芽的保护作用与通过产生的活性氧降解高温诱导的脱落酸有关。当然，对于GABA在高温下如何调控酸枣种子的具体机理还需要从生化和分子水平进一步研究。
该研究从表型上确定了GABA对高温下酸枣种子发芽
有显著的保护作用，并对其保护机理进行了初步探讨，为今后从活性氧角度研究如何调控酸枣种子发芽提供了理论基础[12-13]。
参考文献
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[5] DENG B L，YANG K J，ZHANG Y F，et al.Can heavy metal pollution defend seed germination against heat stress Effect of heavy metals（Cu2+，Cd2+ and Hg2+）on maize seed germination under high temperature[J].Environmental pollution，2016，216：46-52.
[6] ZHANG Y F，DENG B L，LI Z T.Inhibition of NADPH oxidase increases defense enzyme activities and improves maize seed germination under Pb stress[J].Ecotoxicology and environmental safety，2018，158：187-192.
[7] ZHANG Y F，SHI H J，DENG B L.Mutageninduced phytotoxicity in maize seed germination is dependent on ROS scavenging capacity[J].Scientific reports，2018，8（1）：14078.
[8] YANG K J，ZHANG Y F，ZHU L H，et al.Omethoate treatment mitigates high salt stress inhibited maize seed germination[J].Pesticide biochemistry and physiology，2018，144：79-82.
[9] DENG B L，ZHANG Y F，YANG K J，et al.Changes in nonenzymatic antioxidant capacity and lipid peroxidation during germination of white，yellow and purple maize seeds[J].Pak J Bot，2016，48（2）：607-612.
[10] DENG B L，ZHANG Y F，YANG K J，et al.The differential antioxidant capacity of watermelon flesh at different maturity stages and its inhibitory effects on seed aging may explain the significance of fruit flesh colors[J].Acta physiologiae plantarum，2017，39（6）：139-145.
[11] DENG B L，YANG K J，ZHANG Y F，et al.Can antioxidant’s reactive oxygen species（ROS）scavenging capacity contribute to aged seed recovery？ Contrasting effect of melatonin，ascorbate and glutathione on germination ability of aged maize seeds[J].Free radical research，2017，51（9/10）：765-771.
[12] JEEVAN KUMAR S P，RAJENDRA PRASAD S，BANERJEE R，et al.Seed birth to death：Dual functions of reactive oxygen species in seed physiology[J].Annals of botany，2015，116（4）：663-668.
[13] LIU Y G，YE N H，LIU R，et al.H2O2 mediates the regulation of ABA catabolism and GA biosynthesis in Arabidopsis seed dormancy and germination[J].Journal of experimental botany，2010，61（11）：2979-2990.