论文部分内容阅读
GSK3β和E2F1都与神经细胞的分化有关,但它们在神经细胞分化中的关系一直未有报道。本课题采用PC12细胞模型研究了GSK3β与E2F1在神经细胞分化中的相互联系。我们的实验结果显示,在NGF诱导的PC12细胞中,GSK3β的mRNA水平和总蛋白水平都随着NGF刺激时间的增长而增加,而E2F1的mRNA和蛋白水平随着刺激时间的增长而减弱。以前的报道显示GSK3β可以通过磷酸化的途径调控cyclinD,然后cyclinD/Cdks复合物进一步调控Rb基因并抑制E2F1。在研究中,通过报告基因检测,我们发现,GSK3β对E2F1有直接的抑制作用。接着利用GSK3β激酶活性缺失的突变体GSK3βKM和激酶抑制剂TDZD-8,我们发现该抑制作用并不依赖于GSK3β的激酶活性。GSK3β可以直接与E2F1结合,并促进E2F1的泛素化降解,从而抑制E2F1的蛋白水平。由于E2F1是一个自我调控因子,在其启动子上有E2F1的结合位点,所以E2F1蛋白水平的变化也进一步调节了其转录活性。接着,我们又研究了GSK3β对E2F1的调控在神经细胞分化中的作用。首先,我们发现GSK3β与E2F1的相互作用在NGF诱导的情况下是增加的。接着通过免疫荧光的方法,我们观察到在未分化的PC12细胞中,GSK3β与E2F1主要定位在细胞质中,而在NGF刺激的情况下,GSK3β与E2F1逐渐在细胞核中积累。用小鼠的海马区的冰冻切片进行免疫荧光实验,发现在成熟的神经元中,GSK3β与E2F1都定位在细胞质中。这些结果暗示了在神经元的发育中,GSK3β和E2F1起了重要的作用。为了进一步了解GSK3β与E2F1的相互作用对神经细胞分化的影响,我们在PC12细胞中外转GSK3β和E2F1基因,并发现过表达E2F1可以抑制NGF诱导的PC12细胞的分化,而GSK3β能明显回复E2F1的这种抑制作用。而对于不能与E2F1相互作用的GSK3β的剪切体,则没有这种功能。这些结果表明,GSK3β对E2F1的抑制作用在调节神经细胞的分化中是特异的。本研究证明了GSK3β对E2F1的抑制作用。提出了在神经细胞分化过程中,GSK3β不依赖于激酶活性的又一新的调节机制。