【摘 要】
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目的:单碱基编辑器作为一种高效、精确、低脱靶的编辑系统,目前被广泛应用于生物体中.然而,Cas核酸酶本身的免疫原性具有引发机体免疫反应的潜在风险,可能阻碍其在基因治疗中的有效和安全使用.因而本研究旨在构建一种由DHFR介导的可调控腺嘌呤碱基编辑器(adenine base editor,ABE).方法:将大肠杆菌来源的不稳定结构域-二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase,DHFR)的一种突变形式,融合于ABE的不同相对位置,构建数种DD-ABE载体.从已发表的内源基因靶点中挑选三个
【机 构】
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上海交通大学附属第一人民医院眼科 上海201620
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目的:单碱基编辑器作为一种高效、精确、低脱靶的编辑系统,目前被广泛应用于生物体中.然而,Cas核酸酶本身的免疫原性具有引发机体免疫反应的潜在风险,可能阻碍其在基因治疗中的有效和安全使用.因而本研究旨在构建一种由DHFR介导的可调控腺嘌呤碱基编辑器(adenine base editor,ABE).方法:将大肠杆菌来源的不稳定结构域-二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase,DHFR)的一种突变形式,融合于ABE的不同相对位置,构建数种DD-ABE载体.从已发表的内源基因靶点中挑选三个高效位点检测DD-ABE编辑水平.转染四种DD-ABE表达载体,用不同浓度TMP处理,通过Western Blot检测DD-ABE融合蛋白的表达水平.共转染DD-ABE与sgRNA质粒,通过基因组PCR扩增以及Sanger测序检测基因的编辑水平.结果:在构建的四种DD-ABE编辑器中,缺乏TMP的诱导,各组仅有非常少量的DD-ABE融合蛋白表达.TMP最佳工作浓度为10μmol/L.DD-ABE载体加药组的蛋白表达水平以及基因编辑水平均高于未加药组.ABECD未加药组的碱基编辑效率最低,加药组的蛋白表达水平和编辑效率与ABEmax无明显差异.结论:本研究成功构建ABECD作为可调控的ABE,为其体内应用提供了新的技术依据.
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