【摘 要】
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针对柞蚕微孢子虫分子检测受限于繁琐的DNA提取而局限于实验室使用的瓶颈问题,以成本较低的碱裂解法结合磁珠抽提,建立了一种全程在96孔板上使用排枪操作的高通量DNA提取方法
【机 构】
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辽宁省海洋水产科学研究院,辽宁大连116023;辽宁省农业科学院大连生物技术研究所,辽宁大连116085;辽宁省蚕业科学研究所,辽宁丹东,118100
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针对柞蚕微孢子虫分子检测受限于繁琐的DNA提取而局限于实验室使用的瓶颈问题,以成本较低的碱裂解法结合磁珠抽提,建立了一种全程在96孔板上使用排枪操作的高通量DNA提取方法(HT提取),对比HT-冻融法和HT-SDS法2种裂解方法获得的DNA在常规PCR与荧光定量PCR(qPCR)中的检测下限,并进行微粒子病筛查的应用.结果 表明,HT提取法与传统方法相比,无繁琐预处理,操作快速、通量高,污染低、抗干扰、提取DNA品质好,主要耗材能重复使用,可自动化,人力物力成本较低;HT-SDS法具有更稳定的裂解效果,获得的DNA用于常规PCR、qPCR检测下限可达4.5和0.045个/μL;HT-冻融法在常规PCR与qPCR中的检测下限为45和0.45个/μL,而传统抽提方法的常规PCR检测下限仅为110个/μL.结合HT-SDS法和qPCR,对3 000个样品进行微粒子病筛查,结果显示,其检测灵敏度显著高于现行镜检技术,最高高出近11倍,且对低带毒品种优势尤为显著,有望实现在柞蚕种茧微粒子病检疫及柞蚕种质资源保护中的应用,促进柞蚕业发展.
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