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[摘要]目的 建立克林霉素磷酸酯阴道凝胶的微生物限度检查方法。方法 利用氯化钙能与凝胶中的卡波姆结合形成钙盐沉淀达到破胶的目的原理，按照《中国药典》2010年版附录的要求进行方法学验证，细菌计数采用薄膜过滤法、霉菌及酵母菌计数采用平皿法，控制菌检查采用薄膜过滤法。结果 细菌、霉菌及酵母菌的菌回收率均大于70%，控制菌检查中各阳性试验菌均检出，阴性对照无菌生长。结论 本法可消除克林霉素磷酸酯阴道凝胶的抑菌作用，适用于该制剂的微生物限度检查。
关键词 克林霉素磷酸酯阴道凝胶；微生物限度；方法学验证；氯化钙；破胶
克林霉素磷酸酯主要对革兰阳性球菌及厌氧菌有很强的抗菌活性，为了有效控制药品的质量，保证微生物限度检查方法的科学性和检验结果的准确性，根据《中国药典》2010年版[1]附录微生物限度检查的新要求，对克林霉素磷酸酯阴道凝胶栓进行了微生物限度检查的方法学验证。
1 材料
1.1 培养基与试剂pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液、营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基、沙氏葡萄糖液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基、溴化十六烷三甲基三甲铵琼脂培养基。
1.2 菌种金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26 003]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63 501]、大肠埃希氏菌[CMCC(B)44 102]、铜绿假单胞菌[CMCC(B)10 104]、白色念珠菌[CMCC(F)98 001]、黑曲霉[CMCC(F)98 003]。
1.3 样品 克林霉素磷酸酯阴道凝胶（黑龙江多多药业有限责任公司，规格：5g:0.1g）
2 方法与结果
2.1 菌液制备取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的新鲜斜面培养物接种于适宜液体培养基中，按规定条件和时间培养，再分别取上述培养液按要求用适宜溶液按10倍依次稀释法稀释至浓度约为50～100cfu·mL-1备用。
2.2 供试液的制备取本品10 g，加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液80ml，另加入30%氯化钙溶液20ml，置水浴（45℃）保温振摇分散混匀，作为1:10的供试液。
2.3 细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证
2.3.1 试验组取1:10的供试液1ml，加至稀释剂中，依薄膜过滤法过滤，冲洗液用量为500ml，在最后一次冲洗液中加入1ml各细菌试验菌，取出滤膜，菌面朝上，贴于营养琼脂平板上，按规定条件培养，测定细菌数。霉菌及酵母菌采用平皿法：取 1:10供试液1ml，加入各霉菌及酵母菌试验菌1ml,立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，置规定条件培养，
计霉菌及酵母菌数（n=3）。
2.3.2 菌液组吸取各阳性试验菌菌液1ml至平皿中，立即倾入相应的培养基，置规定条
件培养，计阳性菌的菌落数（n=3）。
2.3.3 供试品对照组测定样品本底的菌数，方法同试验组，不加阳性对照菌（n=3）。
2.3.4 稀释剂对照组取试验用稀释剂代替供试液测定，方法同试验组（n=3）。
2.3.5 回收率结果试验组菌回收率％＝（试验组平均菌落数－供试品对照组平均菌落数）/菌液组平均菌落数×100％ 。稀释剂对照组菌回收率％＝稀释剂对照组平均菌落数/菌液组平均菌落数×100％。平均回收率结果见表1
表1细菌、霉菌及酵母菌方法验证的平均回收率（%）
组别金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉
试验组981009110597
稀释级对照组 90 9499 96 96
从表1可以看出，5株试验菌的试验组菌回收率与稀释剂对照组的菌回收率均大于70%，因此，可采用该法测定样品的细菌、霉菌及酵母菌数。
2.4 控制菌检查方法的验证
2.4.1 试验组取1:10供试液10ml（3份），分别加至稀释剂中，依薄膜过滤法过滤，分别以300ml pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，并在最后一次冲洗液中分别加入阳性菌铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌菌液1ml，取出滤膜，分别接种至胆盐乳糖培养基、营养肉汤培养基及沙氏葡萄糖液体培养基各100ml中，摇匀，按规定条件培养。
2.4.2 阴性对照组取等量稀释剂，方法同试验组（不加阳性菌）。
2.4.3 验证结果试验组检出阳性试验菌，阴性对照组无菌生长，见表2。
表2 控制菌检查方法学验证结果
控制菌培养基（试剂）试验组阴性对照组
铜绿假单胞菌 胆盐乳糖增菌培养基 +—
溴化十六烷基三甲铵琼脂呈典型菌落生长无菌生长
金黄色葡萄球菌 营养肉汤培养基 +—
甘露醇氯化钠琼脂培养基呈典型菌落生长无菌生长
白色念珠菌 沙氏葡萄糖液体培养基 +—
沙氏葡萄糖琼脂培养基呈典型菌落生长无菌生长
从表2看出，该控制菌检查方法适用于本品的检查。
3 讨论
克林霉素磷酸酯为化学半合成的克林霉素衍生物，它在体外无抗菌活性，进入机体迅速水解为克林霉素而显示其药理活性，故抗菌谱、抗菌活性及治疗效果与克林霉素相同，但它的脂溶性及渗透性比克林霉素好，与林可霉素相比其抗菌作用强4-8倍，且对厌氧菌感染具有良好的疗效。该品种为阴道及外用制剂，《中国药典》2010年版二部附录微生物限度检查法规定，阴道、尿道给药制剂应增加白色念珠菌的检查。
克林霉素磷酸酯阴道凝胶对细菌具有较强的抑制作用，因此，作者利用氯化钙与凝胶中的卡波姆（丙烯酸交链聚合物）结合形成钙盐沉淀，从而到达破胶的目的，避开了沉淀物[3]，再采用薄膜过滤法进行细菌数及控制菌的测定，使凝胶能够顺利的通过微孔滤膜。
本药
[参考文献]
[1] 中国药典.二部 [ S ]. 2010 : 107-116.
[2] 李云龙.中国药品检验标准操作规范[M].北京: 中国医药科技出版社, 2010:363.
[3] 钱文静,张枚,袁耀佐.盐酸特比萘芬凝胶微生物限度检查方法的验证[J].药物分析杂志,2008,28(12):2135-2139.
关键词 克林霉素磷酸酯阴道凝胶；微生物限度；方法学验证；氯化钙；破胶
克林霉素磷酸酯主要对革兰阳性球菌及厌氧菌有很强的抗菌活性，为了有效控制药品的质量，保证微生物限度检查方法的科学性和检验结果的准确性，根据《中国药典》2010年版[1]附录微生物限度检查的新要求，对克林霉素磷酸酯阴道凝胶栓进行了微生物限度检查的方法学验证。
1 材料
1.1 培养基与试剂pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液、营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基、沙氏葡萄糖液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基、溴化十六烷三甲基三甲铵琼脂培养基。
1.2 菌种金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26 003]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63 501]、大肠埃希氏菌[CMCC(B)44 102]、铜绿假单胞菌[CMCC(B)10 104]、白色念珠菌[CMCC(F)98 001]、黑曲霉[CMCC(F)98 003]。
1.3 样品 克林霉素磷酸酯阴道凝胶（黑龙江多多药业有限责任公司，规格：5g:0.1g）
2 方法与结果
2.1 菌液制备取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的新鲜斜面培养物接种于适宜液体培养基中，按规定条件和时间培养，再分别取上述培养液按要求用适宜溶液按10倍依次稀释法稀释至浓度约为50～100cfu·mL-1备用。
2.2 供试液的制备取本品10 g，加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液80ml，另加入30%氯化钙溶液20ml，置水浴（45℃）保温振摇分散混匀，作为1:10的供试液。
2.3 细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证
2.3.1 试验组取1:10的供试液1ml，加至稀释剂中，依薄膜过滤法过滤，冲洗液用量为500ml，在最后一次冲洗液中加入1ml各细菌试验菌，取出滤膜，菌面朝上，贴于营养琼脂平板上，按规定条件培养，测定细菌数。霉菌及酵母菌采用平皿法：取 1:10供试液1ml，加入各霉菌及酵母菌试验菌1ml,立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，置规定条件培养，
计霉菌及酵母菌数（n=3）。
2.3.2 菌液组吸取各阳性试验菌菌液1ml至平皿中，立即倾入相应的培养基，置规定条
件培养，计阳性菌的菌落数（n=3）。
2.3.3 供试品对照组测定样品本底的菌数，方法同试验组，不加阳性对照菌（n=3）。
2.3.4 稀释剂对照组取试验用稀释剂代替供试液测定，方法同试验组（n=3）。
2.3.5 回收率结果试验组菌回收率％＝（试验组平均菌落数－供试品对照组平均菌落数）/菌液组平均菌落数×100％ 。稀释剂对照组菌回收率％＝稀释剂对照组平均菌落数/菌液组平均菌落数×100％。平均回收率结果见表1
表1细菌、霉菌及酵母菌方法验证的平均回收率（%）
组别金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉
试验组981009110597
稀释级对照组 90 9499 96 96
从表1可以看出，5株试验菌的试验组菌回收率与稀释剂对照组的菌回收率均大于70%，因此，可采用该法测定样品的细菌、霉菌及酵母菌数。
2.4 控制菌检查方法的验证
2.4.1 试验组取1:10供试液10ml（3份），分别加至稀释剂中，依薄膜过滤法过滤，分别以300ml pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，并在最后一次冲洗液中分别加入阳性菌铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌菌液1ml，取出滤膜，分别接种至胆盐乳糖培养基、营养肉汤培养基及沙氏葡萄糖液体培养基各100ml中，摇匀，按规定条件培养。
2.4.2 阴性对照组取等量稀释剂，方法同试验组（不加阳性菌）。
2.4.3 验证结果试验组检出阳性试验菌，阴性对照组无菌生长，见表2。
表2 控制菌检查方法学验证结果
控制菌培养基（试剂）试验组阴性对照组
铜绿假单胞菌 胆盐乳糖增菌培养基 +—
溴化十六烷基三甲铵琼脂呈典型菌落生长无菌生长
金黄色葡萄球菌 营养肉汤培养基 +—
甘露醇氯化钠琼脂培养基呈典型菌落生长无菌生长
白色念珠菌 沙氏葡萄糖液体培养基 +—
沙氏葡萄糖琼脂培养基呈典型菌落生长无菌生长
从表2看出，该控制菌检查方法适用于本品的检查。
3 讨论
克林霉素磷酸酯为化学半合成的克林霉素衍生物，它在体外无抗菌活性，进入机体迅速水解为克林霉素而显示其药理活性，故抗菌谱、抗菌活性及治疗效果与克林霉素相同，但它的脂溶性及渗透性比克林霉素好，与林可霉素相比其抗菌作用强4-8倍，且对厌氧菌感染具有良好的疗效。该品种为阴道及外用制剂，《中国药典》2010年版二部附录微生物限度检查法规定，阴道、尿道给药制剂应增加白色念珠菌的检查。
克林霉素磷酸酯阴道凝胶对细菌具有较强的抑制作用，因此，作者利用氯化钙与凝胶中的卡波姆（丙烯酸交链聚合物）结合形成钙盐沉淀，从而到达破胶的目的，避开了沉淀物[3]，再采用薄膜过滤法进行细菌数及控制菌的测定，使凝胶能够顺利的通过微孔滤膜。
本药
[参考文献]
[1] 中国药典.二部 [ S ]. 2010 : 107-116.
[2] 李云龙.中国药品检验标准操作规范[M].北京: 中国医药科技出版社, 2010:363.
[3] 钱文静,张枚,袁耀佐.盐酸特比萘芬凝胶微生物限度检查方法的验证[J].药物分析杂志,2008,28(12):2135-2139.