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摘要：目的 观察糖络宁对链脲佐菌素（STZ）诱导糖尿病大鼠一般指标及摆尾温度阈值的影响，探讨其对糖尿病性周围神经病变（DPN）的防治作用。方法 采用一次性腹腔内注射60 mg/kg STZ诱导糖尿病大鼠模型。将模型大鼠随机分为模型组、糖络宁组、α-硫辛酸组，每组23只，另取15只大鼠为正常组。糖络宁组予糖络宁20 g/（kg·d）灌胃，α-硫辛酸组予α-硫辛酸20 mg/（kg·d）灌胃，正常组和模型组大鼠予等体积蒸馏水灌胃，连续处理12周。观察大鼠体质量（BM）、空腹血糖（FPG）、糖化血红蛋白（HbA1c）及摆尾温度阈值的变化。结果 与正常组比较，各组糖尿病大鼠BM明显下降（P<0.01），而FPG、HbA1c及摆尾温度阈值均明显升高（P<0.01）；经糖络宁、α-硫辛酸处理后，2组大鼠FPG、HbA1c及摆尾温度阈值均明显改善（P<0.05），但BM无明显变化。糖络宁组大鼠在FPG改善方面与α-硫辛酸组比较差异有统计学意义（P<0.05），其余指标差异均无统计学意义（P>0.05）。结论 糖络宁能有效改善糖尿病大鼠的糖毒性和摆尾温度阈值，对DPN有防治作用。
关键词：糖尿病周围神经病变；糖络宁；糖毒性；摆尾温度阈值；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.06.013
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）06-0035-03
糖尿病性周围神经病变（DPN）是糖尿病最常见的并发症和主要致残原因之一。由于本病的发病机理尚未完全阐明，至今尚无理想的防治药物。高血糖是DPN的始动环节和病理基础。
基金项目：国家自然科学基金（30873253）；国家科技支撑计划（2006BAI04A03-3）
通讯作者：高彦彬，E-mail：gaoyb8@163.com
本研究采用链脲佐菌素（STZ）诱导的速发型糖尿病大鼠模型，观察糖络宁对STZ诱導糖尿病大鼠体质量（BM）、空腹血糖（FPG）、糖化血红蛋白（HbA1c）及摆尾温度阈值的影响，探讨糖络宁对DPN的防治作用。
1 实验材料
1.1 动物
90只8周龄左右SPF级健康雄性SD大鼠，体质量（230±20）g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号：SCXK（京）2002-0003。饲养室温度控制在20 ℃左右，湿度65%左右，12 h明暗交替照明。
1.2 药物与试剂
糖络宁浸膏由黄芪、生地黄、山萸肉、狗脊、丹参等组成，首都医科大学中医药学院制剂中心提供，1 mL浸膏含原药材2 g；α-硫辛酸购自美国Puritan's Pride公司，批号006006；STZ购自美国Sigma公司，批号040103；HbA1c测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所，批号A056；其余试剂均为国产分析纯。
1.3 仪器
全自动生化分析仪（德国西门子）；GD8-DCA2000+糖化血红蛋白分析仪（德国拜耳）；WL9-ONETOUCH Ultra 稳豪血糖仪（美国强生）；紫外可见分光光度仪Lambdal P40型（美国PE公司）；高速离心机5415R型（德国Eppendorf公司）。
2 实验方法
2.1 造模与分组
SD大鼠适应性喂养1周。造模前随机选择15只为正常组，其余大鼠禁食12 h后建模。将STZ溶入0.1 mmol/L枸橼酸钠缓冲液（pH 4.5）配制成0.45%的溶液，按60 mg/kg腹腔注射，72 h后测FPG≥16.7 mmol/L者为STZ诱导糖尿病模型大鼠，共成模69只。将模型大鼠随机分为模型组、糖络宁组（中药组）、α-硫辛酸组（西药组），每组23只。
2.2 给药
中药组予糖络宁原药材20 g/（kg·d）灌胃，西药组予α-硫辛酸20 mg/（kg·d）灌胃，正常组、模型组予等体积蒸馏水灌胃。实验期间大鼠自由食饮，连续给药12周。给药剂量参照人和动物间体表面积折算比率表[1]，治疗用中药按10倍人体剂量配制成糖络宁浸膏（含1 g原药材/mL）；治疗用西药按10倍人体剂量，配成浓度为1 mg/mL的水溶液。
2.3 体质量、血糖测定
每4周检测1次大鼠BM及FPG情况。FPG采用葡萄糖氧化酶法测定。大鼠尾尖部取血，采用微型血糖仪测定，均为禁食8 h后FPG。
2.4 摆尾温度阈值测试
参照Hratzberger等[2]方法，将大鼠宽松地限制在笼内，露出其尾部，当恒温加热仪（每分钟加热2 ℃）至水温40 ℃时，将鼠尾浸入水中约2 cm，鼠尾因水温增高而摆动并露出水面时记录水温，此时水温即为摆尾温度阈值。
2.5 糖化血红蛋白水平检测
大鼠10%水合氯醛麻醉腹主静脉取血至死，留取血清， -70 ℃保存。采用离子交换层析法检测，按试剂盒说明操作。
3 统计学方法
应用SPSS13.0统计软件进行分析。所有数据以—x±s表示，治疗前后自身对照用配对t检验，组间比较用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 一般情况
连续给药后，模型组大鼠逐渐出现多尿、多饮、多食、毛竖无光泽、蜷卧拱背等症状。西药组也有类似表现，但程度较模型组轻。中药组临床症状最轻。整个观察过程中，正常组无动物死亡，模型组死亡4只，中药组死亡1只，西药组死亡3只，最终进入结果分析的动物数量为正常组15只，模型组19只，中药组22只，西药组20只。
4.2 糖络宁对大鼠体质量的影响（见表1）
4.3 糖络宁对大鼠血糖的影响（见表2） 4.4 糖络宁对大鼠糖化血红蛋白的影响（见表3）
4.5 糖络宁对大鼠摆尾温度阈值的影响（见表4）
5 讨论
DPN是糖尿病最常见的慢性微血管并发症之一，其发病机制尚不完全清楚，已知有多种复杂的致病因素如代谢障碍性因素（包括多元醇通路激活、蛋白质非酶促糖基化、蛋白激酶C通路激活、肌醇代谢障碍、氨基己糖途径激活、脂质代谢紊乱、同型半胱氨酸代谢障碍等）、缺血缺氧性损伤、神经营养因子缺乏、氧化应激损伤、遗传基因多态性，以及自身免疫损伤等因素参与DPN的发生发展。在DPN的发生、发展过程中，高血糖是主要触发机制和发病基础[3]。研究表明，在糖尿病大鼠血糖升高的第1个月，显示出感觉及运动神经元传导速度的减慢与诱发痛觉表现（痛觉过敏和异常痛觉）有所进展；在以后的更长时间（糖尿病的6～12个月），轴突病变、脱髓鞘病变及神经变性在糖尿病动物模型中均有发现[4-5]。高血糖可引起DPN细胞损伤，其病理机制主要有以下4条途径，即N-乙酰葡萄糖胺途径、蛋白激酶途径、多元醇途径及糖基化产物，在这4条高血糖损伤通路途径中，多个途径最终环节主要集中在活性氧簇（ROS）上，即以氧化应激为主要作用环节。
本实验研究结果显示，各组糖尿病大鼠的FPG、HbA1c较正常组大鼠明显升高（P<0.01）；中药组能够降低糖尿病大鼠的FPG、HbA1c，差异有统计学意义（P<0.05），提示糖络宁具有一定的降糖作用，而α-硫辛酸对糖尿病大鼠FPG则无显著影响。摆尾温度阈值主要代表无髓纤维和小的有髓纤维的功能，用以检测糖尿病大鼠对温度损伤刺激的反应[6]。中药组和西药组糖尿病大鼠的摆尾温度阈值均明显降低（P<0.05），提示糖络宁和α-硫辛酸均可抑制糖尿病大鼠外周神经纤维损伤，修复其感觉和传导功能，但2组治疗作用比较未见明显差异。本实验研究结果表明，糖络宁可抑制糖尿病大鼠外周神经纤维的进行性损伤，其作用机制与改善糖毒性密切相关。
自发遗传性动物模型和诱发性动物模型为典型的2种糖尿病动物模型。诱发性糖尿病动物模型是通过物理、化学、生物等致病因素人工诱发的糖尿病动物模型，具有耗时短、建模方法简便、成模率高、重复性好的特点；而自发性动物模型存在价格昂贵、饲养困难、成模率低等缺点，其应用受到一定限制。因此，实验过程中多采用大鼠和小鼠制作诱发性糖尿病动物模型，其中以STZ诱导糖尿病大鼠动物模型为最常用。STZ的优点是腹腔注射诱导糖尿病动物模型成功率较高，且对组织毒性小，但一般不会出现自发性缓解[7]；STZ的缺点是剂量过大，则对胰岛细胞破坏程度较严重，易导致动物血糖过高和死亡。本實验采用传统的大剂量一次性注射STZ诱导速发型糖尿病模型大鼠，造成β细胞大量损伤，胰岛素合成和分泌减少，引起糖代谢紊乱，诱发糖尿病。本实验结果表明，一次性腹腔注射大剂量STZ（60 mg/kg）能够快速诱导出糖尿病模型，建模成功率为92%，提示该建模方法比较可靠。
参考文献：
[1] 李仪奎.中药药理实验方法学[M].2版.上海：上海科学技术出版社，
2006：1068.
[2] Hratzberger P， Walter DH， Rittig K， et al. Reversal of experimental diabetic neuropathy by VEGF gene tranfer[J]. J Clin Invest，2001，107（9）：1083-1092.
[3] Skyler JS. Effect of glycemic control on diabetes complications and on the prevention of diabetes[J]. Clinical Diabetes， 2004，22：162-166.
[4] Brussee V， Cunningham FA， Zochodne DW. Direct insulin signaling of neurons reverses diabetic neuropathy[J]. Diabetes，2004，53：1824-1830.
[5] Schmeichel AM， Schmelzer JD. Oxidative injury and apoptosis of dorsal root ganglion neurons in chronic experimental diabetic neuropathy[J]. Diabetes，2003，52：165-171.
[6] Apfel SC. Neurotrophic factors in the therapy of diabetic[J]. Am J Med，1999，107（2B）：S34-S42.
[7] 徐建华，孙中华，颜燕，等.应用于保健食品功能学评价的糖尿病动物模型研究[J].中国卫生检验杂志，2002，12（6）：668-669.
（收稿日期：2012-12-17，编辑：华强）
关键词：糖尿病周围神经病变；糖络宁；糖毒性；摆尾温度阈值；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.06.013
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）06-0035-03
糖尿病性周围神经病变（DPN）是糖尿病最常见的并发症和主要致残原因之一。由于本病的发病机理尚未完全阐明，至今尚无理想的防治药物。高血糖是DPN的始动环节和病理基础。
基金项目：国家自然科学基金（30873253）；国家科技支撑计划（2006BAI04A03-3）
通讯作者：高彦彬，E-mail：gaoyb8@163.com
本研究采用链脲佐菌素（STZ）诱导的速发型糖尿病大鼠模型，观察糖络宁对STZ诱導糖尿病大鼠体质量（BM）、空腹血糖（FPG）、糖化血红蛋白（HbA1c）及摆尾温度阈值的影响，探讨糖络宁对DPN的防治作用。
1 实验材料
1.1 动物
90只8周龄左右SPF级健康雄性SD大鼠，体质量（230±20）g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号：SCXK（京）2002-0003。饲养室温度控制在20 ℃左右，湿度65%左右，12 h明暗交替照明。
1.2 药物与试剂
糖络宁浸膏由黄芪、生地黄、山萸肉、狗脊、丹参等组成，首都医科大学中医药学院制剂中心提供，1 mL浸膏含原药材2 g；α-硫辛酸购自美国Puritan's Pride公司，批号006006；STZ购自美国Sigma公司，批号040103；HbA1c测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所，批号A056；其余试剂均为国产分析纯。
1.3 仪器
全自动生化分析仪（德国西门子）；GD8-DCA2000+糖化血红蛋白分析仪（德国拜耳）；WL9-ONETOUCH Ultra 稳豪血糖仪（美国强生）；紫外可见分光光度仪Lambdal P40型（美国PE公司）；高速离心机5415R型（德国Eppendorf公司）。
2 实验方法
2.1 造模与分组
SD大鼠适应性喂养1周。造模前随机选择15只为正常组，其余大鼠禁食12 h后建模。将STZ溶入0.1 mmol/L枸橼酸钠缓冲液（pH 4.5）配制成0.45%的溶液，按60 mg/kg腹腔注射，72 h后测FPG≥16.7 mmol/L者为STZ诱导糖尿病模型大鼠，共成模69只。将模型大鼠随机分为模型组、糖络宁组（中药组）、α-硫辛酸组（西药组），每组23只。
2.2 给药
中药组予糖络宁原药材20 g/（kg·d）灌胃，西药组予α-硫辛酸20 mg/（kg·d）灌胃，正常组、模型组予等体积蒸馏水灌胃。实验期间大鼠自由食饮，连续给药12周。给药剂量参照人和动物间体表面积折算比率表[1]，治疗用中药按10倍人体剂量配制成糖络宁浸膏（含1 g原药材/mL）；治疗用西药按10倍人体剂量，配成浓度为1 mg/mL的水溶液。
2.3 体质量、血糖测定
每4周检测1次大鼠BM及FPG情况。FPG采用葡萄糖氧化酶法测定。大鼠尾尖部取血，采用微型血糖仪测定，均为禁食8 h后FPG。
2.4 摆尾温度阈值测试
参照Hratzberger等[2]方法，将大鼠宽松地限制在笼内，露出其尾部，当恒温加热仪（每分钟加热2 ℃）至水温40 ℃时，将鼠尾浸入水中约2 cm，鼠尾因水温增高而摆动并露出水面时记录水温，此时水温即为摆尾温度阈值。
2.5 糖化血红蛋白水平检测
大鼠10%水合氯醛麻醉腹主静脉取血至死，留取血清， -70 ℃保存。采用离子交换层析法检测，按试剂盒说明操作。
3 统计学方法
应用SPSS13.0统计软件进行分析。所有数据以—x±s表示，治疗前后自身对照用配对t检验，组间比较用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 一般情况
连续给药后，模型组大鼠逐渐出现多尿、多饮、多食、毛竖无光泽、蜷卧拱背等症状。西药组也有类似表现，但程度较模型组轻。中药组临床症状最轻。整个观察过程中，正常组无动物死亡，模型组死亡4只，中药组死亡1只，西药组死亡3只，最终进入结果分析的动物数量为正常组15只，模型组19只，中药组22只，西药组20只。
4.2 糖络宁对大鼠体质量的影响（见表1）
4.3 糖络宁对大鼠血糖的影响（见表2） 4.4 糖络宁对大鼠糖化血红蛋白的影响（见表3）
4.5 糖络宁对大鼠摆尾温度阈值的影响（见表4）
5 讨论
DPN是糖尿病最常见的慢性微血管并发症之一，其发病机制尚不完全清楚，已知有多种复杂的致病因素如代谢障碍性因素（包括多元醇通路激活、蛋白质非酶促糖基化、蛋白激酶C通路激活、肌醇代谢障碍、氨基己糖途径激活、脂质代谢紊乱、同型半胱氨酸代谢障碍等）、缺血缺氧性损伤、神经营养因子缺乏、氧化应激损伤、遗传基因多态性，以及自身免疫损伤等因素参与DPN的发生发展。在DPN的发生、发展过程中，高血糖是主要触发机制和发病基础[3]。研究表明，在糖尿病大鼠血糖升高的第1个月，显示出感觉及运动神经元传导速度的减慢与诱发痛觉表现（痛觉过敏和异常痛觉）有所进展；在以后的更长时间（糖尿病的6～12个月），轴突病变、脱髓鞘病变及神经变性在糖尿病动物模型中均有发现[4-5]。高血糖可引起DPN细胞损伤，其病理机制主要有以下4条途径，即N-乙酰葡萄糖胺途径、蛋白激酶途径、多元醇途径及糖基化产物，在这4条高血糖损伤通路途径中，多个途径最终环节主要集中在活性氧簇（ROS）上，即以氧化应激为主要作用环节。
本实验研究结果显示，各组糖尿病大鼠的FPG、HbA1c较正常组大鼠明显升高（P<0.01）；中药组能够降低糖尿病大鼠的FPG、HbA1c，差异有统计学意义（P<0.05），提示糖络宁具有一定的降糖作用，而α-硫辛酸对糖尿病大鼠FPG则无显著影响。摆尾温度阈值主要代表无髓纤维和小的有髓纤维的功能，用以检测糖尿病大鼠对温度损伤刺激的反应[6]。中药组和西药组糖尿病大鼠的摆尾温度阈值均明显降低（P<0.05），提示糖络宁和α-硫辛酸均可抑制糖尿病大鼠外周神经纤维损伤，修复其感觉和传导功能，但2组治疗作用比较未见明显差异。本实验研究结果表明，糖络宁可抑制糖尿病大鼠外周神经纤维的进行性损伤，其作用机制与改善糖毒性密切相关。
自发遗传性动物模型和诱发性动物模型为典型的2种糖尿病动物模型。诱发性糖尿病动物模型是通过物理、化学、生物等致病因素人工诱发的糖尿病动物模型，具有耗时短、建模方法简便、成模率高、重复性好的特点；而自发性动物模型存在价格昂贵、饲养困难、成模率低等缺点，其应用受到一定限制。因此，实验过程中多采用大鼠和小鼠制作诱发性糖尿病动物模型，其中以STZ诱导糖尿病大鼠动物模型为最常用。STZ的优点是腹腔注射诱导糖尿病动物模型成功率较高，且对组织毒性小，但一般不会出现自发性缓解[7]；STZ的缺点是剂量过大，则对胰岛细胞破坏程度较严重，易导致动物血糖过高和死亡。本實验采用传统的大剂量一次性注射STZ诱导速发型糖尿病模型大鼠，造成β细胞大量损伤，胰岛素合成和分泌减少，引起糖代谢紊乱，诱发糖尿病。本实验结果表明，一次性腹腔注射大剂量STZ（60 mg/kg）能够快速诱导出糖尿病模型，建模成功率为92%，提示该建模方法比较可靠。
参考文献：
[1] 李仪奎.中药药理实验方法学[M].2版.上海：上海科学技术出版社，
2006：1068.
[2] Hratzberger P， Walter DH， Rittig K， et al. Reversal of experimental diabetic neuropathy by VEGF gene tranfer[J]. J Clin Invest，2001，107（9）：1083-1092.
[3] Skyler JS. Effect of glycemic control on diabetes complications and on the prevention of diabetes[J]. Clinical Diabetes， 2004，22：162-166.
[4] Brussee V， Cunningham FA， Zochodne DW. Direct insulin signaling of neurons reverses diabetic neuropathy[J]. Diabetes，2004，53：1824-1830.
[5] Schmeichel AM， Schmelzer JD. Oxidative injury and apoptosis of dorsal root ganglion neurons in chronic experimental diabetic neuropathy[J]. Diabetes，2003，52：165-171.
[6] Apfel SC. Neurotrophic factors in the therapy of diabetic[J]. Am J Med，1999，107（2B）：S34-S42.
[7] 徐建华，孙中华，颜燕，等.应用于保健食品功能学评价的糖尿病动物模型研究[J].中国卫生检验杂志，2002，12（6）：668-669.
（收稿日期：2012-12-17，编辑：华强）