【摘 要】
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现阶段野生菌株生产琼胶酶还存在诸多问题,如产酶量低、易污染、生长慢等缺点,不利于工业化大规模生产.通过分子生物学手段合成的一段弧菌琼胶酶基因agav-2,对其进行重组表达
【机 构】
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安徽农业大学生命科学院,合肥,230036;徐州工程学院,徐州,221000;浙江泛亚生物医药股份有限公司,平湖,314200
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现阶段野生菌株生产琼胶酶还存在诸多问题,如产酶量低、易污染、生长慢等缺点,不利于工业化大规模生产.通过分子生物学手段合成的一段弧菌琼胶酶基因agav-2,对其进行重组表达.本研究将弧菌琼胶酶基因agav-2插入原核表达载体pET30a(+)中,并转入大肠杆菌BL21(DE3),构建重组表达载体pET-30a(+)-agav-2,对构建的重组子进行诱导表达,利用DNS法测定琼胶酶酶活,对诱导条件和表达的琼胶酶酶学性质进行探究.成功构建重组表达载体pET30a(+)-agav-2,在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(PTG)诱导后,测定酶活58.60 U/mL,通过十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)可知表达的琼胶酶分子量为51.5 kD.诱导条件研究表明最佳诱导温度为30℃,最佳诱导时间为9h,最佳IPrG终浓度为0.7 mmol/L.酶理化性质实验表明该琼胶酶最适温度为45℃,最适pH值为9.0,Ca2+对酶具有显著的激活作用,Mg2+、Fe3+、NH4+、K+、Na+、Mn2+、Fe2+、Ba2+、Cu2+、Ag+对琼胶酶的活力没有显著影响,而Pb2+对琼胶酶的活性有显著抑制作用.酶的稳定性实验显示,100℃处理30 min仍有一定的活性,对pH的适用范围也比较大.构建的重组表达载体pET30a(+)-agav-2,不仅具有很好的工业化生产潜力,同时考虑到琼胶酶对琼脂水解作用而呈现肉眼可见的凹陷状,重组表达载体pET30a(+)-agav-2可作为功能基因筛选的标记工具.
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