【摘 要】
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为探讨蓖麻(Ricinus communis L.)3-磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)基因(RcGAPDH)作为内参基因进行相关研究的可行性,从转录和翻译水平
【机 构】
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泉州师范学院海洋与食品学院,泉州,362000;内蒙古民族大学农学院,通辽,028042;内蒙古通辽市农业科学院,通辽,028015
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为探讨蓖麻(Ricinus communis L.)3-磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)基因(RcGAPDH)作为内参基因进行相关研究的可行性,从转录和翻译水平研究其组织表达谱.本研究以蓖麻雌性花为材料,扩增RcGAPDH (GenBank登录号:XM_002523449)的开放阅读框序列,并将其亚克隆至原核表达载体pET32a(+).酶切、测序结果表明,重组载体pET32a(+)-RcGAPDH构建成功.将pET32a(+)-Rc GA PDH转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中进行优化表达,表达蛋白经纯化后进行Western blotting验证,结果表明,IPTG可诱导一个分子量约62 kD的特异蛋白,且主要以包涵体的形式存在,优化表达条件为:0.5 mmol/L IPTG、28℃、200r/min和诱导表达6h.用表达蛋白作为抗原,免疫新西兰白兔制备抗RcGAPDH的多克隆抗血清,用制备的多克隆抗血清进行Western blotting的结果表明,该多克隆抗血清具针对RcGAPDH的特异性,经ELISA检测,其效价为1∶204 800.通过实时荧光定量RT-PCR (RT-qPCR)检测蓖麻RcGAPDH mRNA在时空一致的条件下的正常生长的根、茎、叶、雌花、雄花和果实中的表达;同时,制备多种组织匀浆蛋白,使用多克隆抗血清进行Western blotting分析,结果表明,蓖麻各组织中RcGAPDH转录水平的表达存在显著差异,RcGAPDH在雌花和雄花中的含量显著高于其他组织中的,但翻译水平的表达差异不显著,可做为在翻译水平研究蓖麻植株中其他基因表达的内参标准.
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