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摘要自从2006年,Takahashi和Yamanaka首次报道了通过逆转录病毒的转导,利用4中转录因子Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc将鼠成纤维细胞诱导为iPS细胞后,许多实验室建立了新的方法优化和改善重编程技术。本篇综述从重编程基因的删除策略,非整合策略,非DNA策略,提高iPS细胞的建系效率等几个方面着重介绍了建立iPS细胞的新方法。
关键词iPS细胞 策略 hECS
中图分类号:Q2文献标识码:A
0 引言
自从2006年,Takahashi和Yamanaka[1]首次报道了通过逆转录病毒的转导,利用4中转录因子Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc将鼠成纤维细胞诱导为iPS细胞后,许多实验室建立了新的方法优化和改善重编程技术。目前,仍存在一些重要的限制条件和缺陷,使iPS细胞不能应用于临床治疗和体外分析:(1)病毒载体系统会永久性地插入受体细胞基因组中,引起插入突变,并遗传给下一代。同时,由于引入了外源DNA,这种插入也会使肿瘤形成的几率大大增加。(2)尽管c-Myc在iPS细胞产生过程中是非必需的,Oct4和 Klf4的异位表达也会引起发育异常。本篇综述从重编程基因的删除策略,非整合策略,非DNA策略,提高iPS细胞的建系效率等几个方面着重介绍了建立iPS细胞的新方法。
1 重编程基因的删除策略
利用Cre-loxp和Piggy Bac(PB)系统可以从iPS细胞的遗传插入位点中移除外源重编程因子。Soldner等人在含有重编程基因的慢病毒载体两端加上loxp位点,随后载体整合进入成纤维细胞基因组中。重编程发生后,利用Cre基因的瞬时表达从iPS细胞中移除重编程因子。这种慢病毒载体系统用于建立人iPS细胞系。移除了重编程因子的iPS细胞的基因表达谱与hESC更为接近。Cre介导的重编程基因删除具有高效,精确的优点,但是iPS基因组中仍保留一个loxp位点和一段载体DNA片段,可能引起插入突变。
PB转座子可精确地切除自身及外源DNA,并且不会在重编程细胞的基因组中留下任何“痕迹”。Woltjen等人将重编程因子插入PB转座子的5’和3’末端重复序列之间,在转座酶的作用下,PB转座子整合进入成纤维细胞基因组。重编程后,PB转座酶瞬时表达切除了PB转座子,在整合位点并未留下任何“痕迹”。通过PB转座系统产生人iPS细胞的操作类似,但由于转座效率低,产生的iPS细胞拷贝数较鼠中相对较低。除此以外,PB重编程系统较传统逆转录病毒方法产生iPS细胞的效率更高,也更安全,便于应用。
2 非整合策略
Stadtfeld等人将携带有重编程因子的腺病毒载体导入肝细胞,iPS细胞的产生效率达到0.0005℅。Okita等人利用环状质粒载体的转染这一过程的稳定整合效率低达1-0.01℅这一优点,在重编程因子表达的8-12天中,随着重复转染次数增加,质粒随机丢失。尽管诱导效率很低,这些结论首次证明了转基因插入对重编程过程不是必须的。需要指出的是,这些方法均未被应用于产生人iPS细胞,在此过程中没有外源因子的整合。含有EBNA-1表达盒和orip序列的质粒在细胞核中维持较低拷贝数,在灵长类动物细胞中,每周期复制一次。在筛选压力下,1%被转染细胞中质粒以附加体形式存在。不存在筛选压力的情况下,质粒则以每细胞周期5%的速率丢失。从利用29种不同的附加体质粒的组合所进行的大量实验中,包括了Oct4,Sox2,Nanog,Lin28,Klf4,c-Myc和SV40大T抗原的三种组合均首次未经过遗传操作成功地产生了人iPS细胞。
3 非DNA策略
尽管某些小分子成功取代了转录因子的作用,蛋白转导是首个能完全取代基因传递的策略。Zhou等人纯化了Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc蛋白,这些蛋白包含了聚精氨酸肽标签,在培养集中可允许重组重编程蛋白通过质膜。在加入了组蛋白去乙酰基酶抑制剂和2-丙基戊酸(VPA)后,经过4轮蛋白补充和23-28天的连续培养,从5€?04个MEF中成功产生了3个iPS克隆。目前仍不清楚是否蛋白转导也可被用于成年细胞,这一过程比新生细胞或胚胎细胞的重编程更加困难。然而,蛋白转导避免了从基因水平上筛选iPS细胞和常规的染色体核型分析。
4 提高iPS细胞的建系效率
低建系效率一直是建立iPS细胞的主要障碍,通常只有0.01-0.2℅。若减少转录因子的导入,或不使用逆转录病毒或慢病毒作为载体,其效率更低。最近,几个研究小组的报道称敲除P53基因可将重编程效率提高10%。从提高建系效率方面考虑,这项发现是建立iPS细胞技术的又一伟大进步。然而,严谨地说,诱导iPS细胞的四个转录因子均可被划分为癌基因。众所周知,c-Myc是一种原癌基因;在人乳腺癌干细胞和膀胱癌细胞中均发现Oct4基因过表达。此外,在人胃癌细胞中检测到Sox2基因的表达,Klf4与许多种癌细胞的形成过程相关。P53 基因是肿瘤抑制基因,它可校核重编程过程,并通过细胞衰老与凋亡机制抑制癌细胞形成。若将其剔除,肿瘤形成的风险大大提高。目前,iPS细胞和癌细胞的关系仍不清楚。寻找提高iPS细胞建系效率的方法,仍是iPS细胞研究的主要任务之一。
(下转第104页)(上接第68页)
5 结论
利用逆转录病毒转染与小分子物质及候补的起始细胞类型结合的方法,诱导效率已经被提高至100倍。许多新的不利用遗传修饰的策略也被用于建立iPS细胞。然而这些策略的成功多基于哺乳动物实验。为了实现在人类细胞中的应用,这些方法的效率仍有待提高。同时,iPS细胞的致癌性,建系的低效性,以及逃避了自然选择而引起的一系列问题,仍需要进一步研究。目前,iPS细胞形成机理还不清楚,在应用于临床治疗之前,这些问题均有待解决。
参考文献
[1]Takahashi, K. and Yamanaka, S. (2006) Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126, 663–676.
[2]Soldner F, Hockemeyer D, Beard C, Gao Q, Bell GW, Cook EG, Hargus G, Blak A, Cooper O, Mitalipova M et al.: Parkinson’s disease patient-derived induced pluripotent stem cells free of viral reprogramming factors. Cell 2009, 136:964-977.
[3]Woltjen K, Michael IP, Mohseni P, Desai R, Mileikovsky M,Hamalainen R, Cowling R, Wang W, Liu P, Gertsenstein M et al.:Piggy Bac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature 2009, 458:766-770.
[4]Stadtfeld M, Nagaya M, Utikal J,Weir G, Hochedlinger K: Induced pluripotent stem cells generated without viral integration.Science 2008, 322:945-949.
[5]Okita K, Nakagawa M, Hyenjong H, Ichisaka T, Yamanaka S:Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science 2008, 322:949-953.
关键词iPS细胞 策略 hECS
中图分类号:Q2文献标识码:A
0 引言
自从2006年,Takahashi和Yamanaka[1]首次报道了通过逆转录病毒的转导,利用4中转录因子Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc将鼠成纤维细胞诱导为iPS细胞后,许多实验室建立了新的方法优化和改善重编程技术。目前,仍存在一些重要的限制条件和缺陷,使iPS细胞不能应用于临床治疗和体外分析:(1)病毒载体系统会永久性地插入受体细胞基因组中,引起插入突变,并遗传给下一代。同时,由于引入了外源DNA,这种插入也会使肿瘤形成的几率大大增加。(2)尽管c-Myc在iPS细胞产生过程中是非必需的,Oct4和 Klf4的异位表达也会引起发育异常。本篇综述从重编程基因的删除策略,非整合策略,非DNA策略,提高iPS细胞的建系效率等几个方面着重介绍了建立iPS细胞的新方法。
1 重编程基因的删除策略
利用Cre-loxp和Piggy Bac(PB)系统可以从iPS细胞的遗传插入位点中移除外源重编程因子。Soldner等人在含有重编程基因的慢病毒载体两端加上loxp位点,随后载体整合进入成纤维细胞基因组中。重编程发生后,利用Cre基因的瞬时表达从iPS细胞中移除重编程因子。这种慢病毒载体系统用于建立人iPS细胞系。移除了重编程因子的iPS细胞的基因表达谱与hESC更为接近。Cre介导的重编程基因删除具有高效,精确的优点,但是iPS基因组中仍保留一个loxp位点和一段载体DNA片段,可能引起插入突变。
PB转座子可精确地切除自身及外源DNA,并且不会在重编程细胞的基因组中留下任何“痕迹”。Woltjen等人将重编程因子插入PB转座子的5’和3’末端重复序列之间,在转座酶的作用下,PB转座子整合进入成纤维细胞基因组。重编程后,PB转座酶瞬时表达切除了PB转座子,在整合位点并未留下任何“痕迹”。通过PB转座系统产生人iPS细胞的操作类似,但由于转座效率低,产生的iPS细胞拷贝数较鼠中相对较低。除此以外,PB重编程系统较传统逆转录病毒方法产生iPS细胞的效率更高,也更安全,便于应用。
2 非整合策略
Stadtfeld等人将携带有重编程因子的腺病毒载体导入肝细胞,iPS细胞的产生效率达到0.0005℅。Okita等人利用环状质粒载体的转染这一过程的稳定整合效率低达1-0.01℅这一优点,在重编程因子表达的8-12天中,随着重复转染次数增加,质粒随机丢失。尽管诱导效率很低,这些结论首次证明了转基因插入对重编程过程不是必须的。需要指出的是,这些方法均未被应用于产生人iPS细胞,在此过程中没有外源因子的整合。含有EBNA-1表达盒和orip序列的质粒在细胞核中维持较低拷贝数,在灵长类动物细胞中,每周期复制一次。在筛选压力下,1%被转染细胞中质粒以附加体形式存在。不存在筛选压力的情况下,质粒则以每细胞周期5%的速率丢失。从利用29种不同的附加体质粒的组合所进行的大量实验中,包括了Oct4,Sox2,Nanog,Lin28,Klf4,c-Myc和SV40大T抗原的三种组合均首次未经过遗传操作成功地产生了人iPS细胞。
3 非DNA策略
尽管某些小分子成功取代了转录因子的作用,蛋白转导是首个能完全取代基因传递的策略。Zhou等人纯化了Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc蛋白,这些蛋白包含了聚精氨酸肽标签,在培养集中可允许重组重编程蛋白通过质膜。在加入了组蛋白去乙酰基酶抑制剂和2-丙基戊酸(VPA)后,经过4轮蛋白补充和23-28天的连续培养,从5€?04个MEF中成功产生了3个iPS克隆。目前仍不清楚是否蛋白转导也可被用于成年细胞,这一过程比新生细胞或胚胎细胞的重编程更加困难。然而,蛋白转导避免了从基因水平上筛选iPS细胞和常规的染色体核型分析。
4 提高iPS细胞的建系效率
低建系效率一直是建立iPS细胞的主要障碍,通常只有0.01-0.2℅。若减少转录因子的导入,或不使用逆转录病毒或慢病毒作为载体,其效率更低。最近,几个研究小组的报道称敲除P53基因可将重编程效率提高10%。从提高建系效率方面考虑,这项发现是建立iPS细胞技术的又一伟大进步。然而,严谨地说,诱导iPS细胞的四个转录因子均可被划分为癌基因。众所周知,c-Myc是一种原癌基因;在人乳腺癌干细胞和膀胱癌细胞中均发现Oct4基因过表达。此外,在人胃癌细胞中检测到Sox2基因的表达,Klf4与许多种癌细胞的形成过程相关。P53 基因是肿瘤抑制基因,它可校核重编程过程,并通过细胞衰老与凋亡机制抑制癌细胞形成。若将其剔除,肿瘤形成的风险大大提高。目前,iPS细胞和癌细胞的关系仍不清楚。寻找提高iPS细胞建系效率的方法,仍是iPS细胞研究的主要任务之一。
(下转第104页)(上接第68页)
5 结论
利用逆转录病毒转染与小分子物质及候补的起始细胞类型结合的方法,诱导效率已经被提高至100倍。许多新的不利用遗传修饰的策略也被用于建立iPS细胞。然而这些策略的成功多基于哺乳动物实验。为了实现在人类细胞中的应用,这些方法的效率仍有待提高。同时,iPS细胞的致癌性,建系的低效性,以及逃避了自然选择而引起的一系列问题,仍需要进一步研究。目前,iPS细胞形成机理还不清楚,在应用于临床治疗之前,这些问题均有待解决。
参考文献
[1]Takahashi, K. and Yamanaka, S. (2006) Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126, 663–676.
[2]Soldner F, Hockemeyer D, Beard C, Gao Q, Bell GW, Cook EG, Hargus G, Blak A, Cooper O, Mitalipova M et al.: Parkinson’s disease patient-derived induced pluripotent stem cells free of viral reprogramming factors. Cell 2009, 136:964-977.
[3]Woltjen K, Michael IP, Mohseni P, Desai R, Mileikovsky M,Hamalainen R, Cowling R, Wang W, Liu P, Gertsenstein M et al.:Piggy Bac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature 2009, 458:766-770.
[4]Stadtfeld M, Nagaya M, Utikal J,Weir G, Hochedlinger K: Induced pluripotent stem cells generated without viral integration.Science 2008, 322:945-949.
[5]Okita K, Nakagawa M, Hyenjong H, Ichisaka T, Yamanaka S:Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science 2008, 322:949-953.