【摘 要】
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[目的]烟草(Nicotiana tabacum L.)碱性几丁质酶基因PR3b在低烟碱突变体(nic1和nic2)中存在转录后mRNA可变剪切现象,但其可变剪切的发生机制仍不清楚.将PR3b的可变剪切元件NR
【机 构】
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中国农业科学院烟草研究所,山东青岛,266101西南大学农学与生物技术学院,重庆,400716;
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[目的]烟草(Nicotiana tabacum L.)碱性几丁质酶基因PR3b在低烟碱突变体(nic1和nic2)中存在转录后mRNA可变剪切现象,但其可变剪切的发生机制仍不清楚.将PR3b的可变剪切元件NRSE1(nicotine-synthesis related splicing element 1)与GUS融合表达,分析NRSE1元件的独立可变剪切特性,以揭示其作用机制.[方法]利用PCR扩增方法获得PR3b cDNA序列中的NRSE1元件片段,并利用基因重组技术构建了烟草PR3b可变剪切元件NRSE1与GUS的融合表达载体.将融合表达载体导入农杆菌LBA4404后,通过农杆菌介导的叶盘转化法培育了表达NRSE1与GUS融合子的低烟碱突变体nic1和nic2及野生型烟草转基因植株;通过RT-PCR检测及GUS染色鉴定出阳性植株后,利用RT-PCR分析NRSE1与GUS融合表达后在低烟碱突变体和野生型烟草中的可变剪切特性;对转基因植株的幼苗进行乙烯(ET)和茉莉酸(JA)处理,通过GUS染色方法分析ET和JA处理对转基因植株中GUS活性的影响,并通过RT-PCR方法分析ET和JA处理对转基因植株中NRSE1与GUS融合子的可变剪切特性影响,以及对转基因植株中NRSE1与GUS融合子表达水平的影响.[结果]通过RT-PCR检测及GUS染色鉴定出表达NRSE1元件与GUS融合子的低烟碱突变体和野生型烟草转基因植株;RT-PCR检测及测序分析证明,NRSE1元件与GUS融合表达后仍能在低烟碱突变体发生高水平的可变剪切,剪切修饰区段的序列变化与烟草中PR3b的mRNA可变剪切修饰一致;利用ET和JA处理转基因植株进行的GUS染色表明,ET和JA处理对转基因植株的GUS活性有不同程度的影响;但利用ET和JA处理转基因植株进行的RT-PCR分析表明,ET和JA处理不改变NRSE1元件原有的诱导剪切特性,也不影响转基因植株中NRSE1元件与GUS融合子的表达水平.[结论]PR3b的可变剪切元件NRSE1与GUS在烟草中融合表达后,仍能在低烟碱突变体nic1和nic2中发生高水平的可变剪切;NRSE1在烟草中的可变剪切不依赖PR3b的其他mRNA区段,是烟草PR3b发生可变剪切的独立元件;ET和JA处理对NRSE1元件与GUS融合表达植株的GUS活性具有一定影响,可能存在翻译水平的调控作用.
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