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[摘要] 目的 建立简便和灵敏的双试剂自动化分析法测定血清D-3羟丁酸。 方法 在NAD和D-3羟丁酸脱氢酶存在下，用氯化硝基四氮唑兰（NBT）作为显色剂测定血清中的D-3羟丁酸。 结果 该法线性范围为0～7.0mmol/L，平均回收率为98.7%，批内变异系数和批间变异系数均小于2%，与对照试剂盒比较有良好的相关性（r2 =0.996），具有良好的抗干扰能力。150例健康人血清D-3羟丁酸含量为0.03～0.30mmol/L。 结论 NBT自动分析法测定D-3羟丁酸方法简便、灵敏可靠、适合临床应用。
[关键词] D-3羟丁酸；血清；自动分析法；NBT
[中图分类号] R446.1 [文獻标识码] B [文章编号] 2095-0616（2014）13-115-03
[Abstract] Objective To establish a simple and sensitive automatic method for determination of D-3-hydroxybutyric acid in serum with two reagents. Methods With the existence of NAD and D-3-hydroxybutyrate dehydrogenase， D-3-hydroxybutyric acid in serum was determined by NBT as a color-developing agent. Results The linearity range of the method was 0-7.0 mmol/L， average recovery rate was 98.7%， and both the intra-assay and inter-assay coefficients of variation were less than 2%. There was a good correlation compared with the reference kit （r2=0.996）， and the capacity of resisting interference was good. The concentration of D-3-hydroxybutyric acid in the serum of 150 healthy people was 0.03-0.30 mmol/L. Conclusion The NBT automatic analysis method for determination of D-3-hydroxybutyric acid is simple， sensitive and reliable， which is appropriate to be applied clinically.
[Key words] D-3-hydroxybutyric acid； Serum； Automatic analysis method； NBT
糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢性疾病，酮症及酮症酸中毒是糖尿病患者最常见的并发症[1-2]，糖尿病酮症酸中毒是指糖尿病患者在各种原因的作用下，胰岛素不足，生糖激素异常升高，而导致的高血糖、高血酮、水电解质酸碱失衡等。在肝脏中，脂肪酸氧化分解的中间产物乙酰乙酸、D-3羟丁酸及丙酮，三者统称为酮体，其中D-3羟丁酸是酮体主要的成分，约占其总量的70%，因此临床以检测血清中D-3羟丁酸的浓度来反映体内酮体的水平[3-4]。D-3羟丁酸检测方法有气相色谱法[5]、分光度法和酶法，酶法在准确性、抗干扰能力和重复性等方面具有特殊的优势[6]，但价格都比较昂贵。而国内现有国产D-3羟丁酸试剂盒所用的显色剂均为INT，还没有使用NBT作为显色剂的方法。我们首次报道以NBT作为显色剂，双试剂两点终点法自动化测定血清D-3羟丁酸的新方法。该法准确、灵敏、稳定，值得临床推广。
实验原理：采用酶化学比色法来测定血清中的D-3羟丁酸，先将血清中的D-3羟丁酸氧化为乙酰乙酸，同时将辅酶Ⅰ还原为还原型辅酶Ⅰ，还原型辅酶Ⅰ在黄递酶的催化下将NBT生成红色显色物质，在505nm处检测吸光度的变化来计算血清中D-3羟丁酸的浓度。
D-3羟丁酸 +辅酶Ⅰ乙酰乙酸 +还原型辅Ⅰ
还原型辅酶Ⅰ+NBT formazane（红色）
1 材料与方法
1.1 试剂
2 结果
2.1 灵敏度
将总浓度为1.0mmol/L的D-3羟丁酸用生理盐水将做100倍稀释，同时测定10次，分别计算出各浓度梯度的标准差和平均值；当D-3羟丁酸的浓度为0.01mmol/L时，平均值-3标准差>3标准差。表明灵敏度可达0.01mmol/L。
2.2 线性范围
使用生理盐水对1份D-3羟丁酸浓度为8mmol/L的高值血清样本进行稀释，分别是0.01、0.02、0.04、0.08、0.20、0.40、0.80、2.00、4.00、8.00mmol/L 10个不同浓度，各浓度均检测5次， 进行相关分析，以每个浓度对应的吸光度值为y，对应的理论浓度为x。发现在0.01～8.00mmol/L浓度梯度内线性回归方程为y=1.0023x + 0.0032，r2=0.996，表明该方法在此浓度范围内呈线性。
2.3 精密度
分别对RANDOX公司的低值和高值质控以及1份患者随机血清共3个样本每天测定3次，检测平均值和变异系数（CV值），连续测定20d。见表1。
2.4 方法对比试验
分别用德国Diasys公司D-3羟丁酸试剂盒（x）和本试验方法（y）对80份浓度范围在0.01～8.00mmol/L的D-3羟丁酸临床血清标本进行检测，试验结果进行相关性分析，考察两种方法的相关性，最终得到的结果为：y=0.975x+0.34，r2=0.995，实验结果表明，本方法的实验结果与德国Diasys公司的D-3羟丁酸试剂盒具有良好的相关性。 2.5 回收试验
用RANDOX的D-3羟丁酸浓度为0.5mmol/L标准血清进行回收试验，来评价此方法的准确性，分别加入0.124mmol/L、0.642 mmol/L、2.471mmol/L的标准液，用来组成基础样本、回收样本1和回收样本2，回收率（%）=（回收样本检测值-基础样本检测值）/加入的标准液浓度，最终计算回收率为96.2%～102.4%，平均回收率为98.7%，说明该方法具有不错的检测准确性。
2.6 干扰试验
取1份混合血清，分别配成不同浓度的胆红素、甘油三酯和血红蛋白血清样本，使用生理盐水作对照，各个样本均检测10次，最终分析发现：三种常见的干扰物分别在100mg/dL、200mg/dL和200mg/dL时，对本试剂几乎无干扰。
2.7 稳定试验
加入防腐剂和稳定剂后，放于37℃中保存10d穩定性正常，测定结果没有明显变化，在4℃中能够开口保存30d稳定性正常。
2.8 正常参考范围
选择150名体检合格成年人，男80名，女70名，年龄20～65岁。空腹静脉取血，用本法测的P2.5=0.03，P97.5=0.3因此得出正常人随机血清D-3羟丁酸含量参考范围是0.03～0.30mmol/L。
3 讨论
近年来，我国糖尿病患病率逐渐增加，当发生此病机体细胞内葡萄糖的氧化利用障碍，此时机体动用体内脂肪，通过脂肪分解供能，肝脏脂肪酸代谢旺盛，产生大量酮体，从而导致酮症酸中毒的发生，所以及时准确的诊断此症的发生，对后续治疗有较大的临床意义。测定血液中D-3羟丁酸的浓度对糖尿病酮症酸中毒的诊断有着重要意义。在酮症酸中毒早期，尿酮水平无法测定时，血液中D-3羟丁酸即可测定。当患者出现酮症酸中毒的时候，血液中D-3羟丁酸浓度升高，此时检测血液中D-3羟丁酸浓度可以有效的检测患者的病情以及预测预后。目前国产试剂中均使用了INT作为显色剂，这种试剂具有稳定性差，使用不方便等方面的问题，故建立了一种新型的检测D-3羟丁酸的方法非常有必要[10-12]。
试剂中我们对黄递酶和D-3羟丁酸的浓度进行了梯度分析，最终选择现在的浓度，这样既保证了反应的线性和准确性，又可以通过添加保护剂保证了酶的稳定性，而且可以去除胆红素、甘油三酯的干扰。通过回收试验和对比试验，试剂的准确性较高。通过精密度试验，试剂的重复性较好。同时该方法的灵敏度为0.01mmol/L，该灵敏度完全能够保证临床检测的需要。0.01～8.00mmol/L的检测线性范围，与国外的试剂相比，具有更宽的线性范围，能够保证高值样本准确的检测。从稳定性试验来看，该方法在该试剂在37℃和开口4℃中均能够保证很好的稳定性，解决了保存的问题，表明在方法的试剂在市场应用中具有很好的前景。我们研究使用NBT作为显色剂的D-3羟丁酸试剂盒相比现有的试剂盒拥有更好的线性范围和稳定性，而准确性与国外的试剂盒比较也有很好的相关。实验结果表明选用NBT作为显色剂的该检测方法具有很好的前景，是一种适用于临床的值得推广的方法。
[参考文献]
[1] Baena MG，Cayón M，Ortego-Rojo J，et al. Diabetic ketoacidosis associated with severe hypog- lycemia[J]. J Endocrinol Invest，2010，33（5）：358-359.
[2] Minuto N，Tambroni B，Vannati M，et al. Ketoacidosis caused by exposure of insulin to low temperature[J].Diabetes Technol Ther，2010，2（9）：745-746.
[3] Tsai YC，Liao TH，Lee JA. Identification of L-3-hydroxybutyrate as an original ketone body in rat serum by column-switching high-performance liquid chromatography and fluorescence derivatization[J].Anal Biochem，2003，319（1）：34-41.
[4] Yamamoto T，Iwai M，Kimura S，et al. The mechanism of action of hepatic sympathetic nerves on ketone-body output from perfused rat liver. The effect of the interaction of noradrenaline with ATP on the release of beta-hydroxybutyrate[J]. Eur J Biochem，1995，234（2）：466-471.
[5] Hassan HM，Cooper GA. Determination of beta-hydroxybutyrate in blood and urine using gas chromatography- mass spectrometry[J].J Anal Toxicol，2009，33（8）：502-507.
[6] Hoque MM，Shimizu S，Hossain MT，et al. The structures of Alcaligenes faecalis D-3-hydroxybutyrate dehydrogenase before and after NAD+ and acetate binding suggest a dynamical reaction mechanism as a member of the SDR family[J]. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr，2008，64（5）：496-505.
[7] EP05-A.Evaluation of precision performance of clinical chemistry devices；Approved Guide- line[S].NCCLS （http：//www.NCCLS.org）.
[8] EP06-A.Evaluation of the linearity of quantitative analytical methods：Approved Guideline[S].NCCLS（http：//www.NCCLS.org）.
[9] EP07-A.Interference testing in clinical chemistry；Proposed Guideline[S].NCCLS（http：//www.NCCLS.org）.
[10] 胡荣盛，邱彬，朱振坤.血清β-羟丁酸酶法测定的方法学和临床应用评价[J].江西医学检验，2007，25 （4）： 335-337.
[11] 钟延法.联合检测血糖、糖化血清蛋白、D-3羟丁酸在糖尿病中的应用价值[J].中国医药导刊，2013，15 （21）：191-192.
[12] 王小平.全自动生化仪可比性分析[J].检验医学与临床，2013，10（3）： 279-280，282.
（收稿日期：2014-04-24）
[关键词] D-3羟丁酸；血清；自动分析法；NBT
[中图分类号] R446.1 [文獻标识码] B [文章编号] 2095-0616（2014）13-115-03
[Abstract] Objective To establish a simple and sensitive automatic method for determination of D-3-hydroxybutyric acid in serum with two reagents. Methods With the existence of NAD and D-3-hydroxybutyrate dehydrogenase， D-3-hydroxybutyric acid in serum was determined by NBT as a color-developing agent. Results The linearity range of the method was 0-7.0 mmol/L， average recovery rate was 98.7%， and both the intra-assay and inter-assay coefficients of variation were less than 2%. There was a good correlation compared with the reference kit （r2=0.996）， and the capacity of resisting interference was good. The concentration of D-3-hydroxybutyric acid in the serum of 150 healthy people was 0.03-0.30 mmol/L. Conclusion The NBT automatic analysis method for determination of D-3-hydroxybutyric acid is simple， sensitive and reliable， which is appropriate to be applied clinically.
[Key words] D-3-hydroxybutyric acid； Serum； Automatic analysis method； NBT
糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢性疾病，酮症及酮症酸中毒是糖尿病患者最常见的并发症[1-2]，糖尿病酮症酸中毒是指糖尿病患者在各种原因的作用下，胰岛素不足，生糖激素异常升高，而导致的高血糖、高血酮、水电解质酸碱失衡等。在肝脏中，脂肪酸氧化分解的中间产物乙酰乙酸、D-3羟丁酸及丙酮，三者统称为酮体，其中D-3羟丁酸是酮体主要的成分，约占其总量的70%，因此临床以检测血清中D-3羟丁酸的浓度来反映体内酮体的水平[3-4]。D-3羟丁酸检测方法有气相色谱法[5]、分光度法和酶法，酶法在准确性、抗干扰能力和重复性等方面具有特殊的优势[6]，但价格都比较昂贵。而国内现有国产D-3羟丁酸试剂盒所用的显色剂均为INT，还没有使用NBT作为显色剂的方法。我们首次报道以NBT作为显色剂，双试剂两点终点法自动化测定血清D-3羟丁酸的新方法。该法准确、灵敏、稳定，值得临床推广。
实验原理：采用酶化学比色法来测定血清中的D-3羟丁酸，先将血清中的D-3羟丁酸氧化为乙酰乙酸，同时将辅酶Ⅰ还原为还原型辅酶Ⅰ，还原型辅酶Ⅰ在黄递酶的催化下将NBT生成红色显色物质，在505nm处检测吸光度的变化来计算血清中D-3羟丁酸的浓度。
D-3羟丁酸 +辅酶Ⅰ乙酰乙酸 +还原型辅Ⅰ
还原型辅酶Ⅰ+NBT formazane（红色）
1 材料与方法
1.1 试剂
2 结果
2.1 灵敏度
将总浓度为1.0mmol/L的D-3羟丁酸用生理盐水将做100倍稀释，同时测定10次，分别计算出各浓度梯度的标准差和平均值；当D-3羟丁酸的浓度为0.01mmol/L时，平均值-3标准差>3标准差。表明灵敏度可达0.01mmol/L。
2.2 线性范围
使用生理盐水对1份D-3羟丁酸浓度为8mmol/L的高值血清样本进行稀释，分别是0.01、0.02、0.04、0.08、0.20、0.40、0.80、2.00、4.00、8.00mmol/L 10个不同浓度，各浓度均检测5次， 进行相关分析，以每个浓度对应的吸光度值为y，对应的理论浓度为x。发现在0.01～8.00mmol/L浓度梯度内线性回归方程为y=1.0023x + 0.0032，r2=0.996，表明该方法在此浓度范围内呈线性。
2.3 精密度
分别对RANDOX公司的低值和高值质控以及1份患者随机血清共3个样本每天测定3次，检测平均值和变异系数（CV值），连续测定20d。见表1。
2.4 方法对比试验
分别用德国Diasys公司D-3羟丁酸试剂盒（x）和本试验方法（y）对80份浓度范围在0.01～8.00mmol/L的D-3羟丁酸临床血清标本进行检测，试验结果进行相关性分析，考察两种方法的相关性，最终得到的结果为：y=0.975x+0.34，r2=0.995，实验结果表明，本方法的实验结果与德国Diasys公司的D-3羟丁酸试剂盒具有良好的相关性。 2.5 回收试验
用RANDOX的D-3羟丁酸浓度为0.5mmol/L标准血清进行回收试验，来评价此方法的准确性，分别加入0.124mmol/L、0.642 mmol/L、2.471mmol/L的标准液，用来组成基础样本、回收样本1和回收样本2，回收率（%）=（回收样本检测值-基础样本检测值）/加入的标准液浓度，最终计算回收率为96.2%～102.4%，平均回收率为98.7%，说明该方法具有不错的检测准确性。
2.6 干扰试验
取1份混合血清，分别配成不同浓度的胆红素、甘油三酯和血红蛋白血清样本，使用生理盐水作对照，各个样本均检测10次，最终分析发现：三种常见的干扰物分别在100mg/dL、200mg/dL和200mg/dL时，对本试剂几乎无干扰。
2.7 稳定试验
加入防腐剂和稳定剂后，放于37℃中保存10d穩定性正常，测定结果没有明显变化，在4℃中能够开口保存30d稳定性正常。
2.8 正常参考范围
选择150名体检合格成年人，男80名，女70名，年龄20～65岁。空腹静脉取血，用本法测的P2.5=0.03，P97.5=0.3因此得出正常人随机血清D-3羟丁酸含量参考范围是0.03～0.30mmol/L。
3 讨论
近年来，我国糖尿病患病率逐渐增加，当发生此病机体细胞内葡萄糖的氧化利用障碍，此时机体动用体内脂肪，通过脂肪分解供能，肝脏脂肪酸代谢旺盛，产生大量酮体，从而导致酮症酸中毒的发生，所以及时准确的诊断此症的发生，对后续治疗有较大的临床意义。测定血液中D-3羟丁酸的浓度对糖尿病酮症酸中毒的诊断有着重要意义。在酮症酸中毒早期，尿酮水平无法测定时，血液中D-3羟丁酸即可测定。当患者出现酮症酸中毒的时候，血液中D-3羟丁酸浓度升高，此时检测血液中D-3羟丁酸浓度可以有效的检测患者的病情以及预测预后。目前国产试剂中均使用了INT作为显色剂，这种试剂具有稳定性差，使用不方便等方面的问题，故建立了一种新型的检测D-3羟丁酸的方法非常有必要[10-12]。
试剂中我们对黄递酶和D-3羟丁酸的浓度进行了梯度分析，最终选择现在的浓度，这样既保证了反应的线性和准确性，又可以通过添加保护剂保证了酶的稳定性，而且可以去除胆红素、甘油三酯的干扰。通过回收试验和对比试验，试剂的准确性较高。通过精密度试验，试剂的重复性较好。同时该方法的灵敏度为0.01mmol/L，该灵敏度完全能够保证临床检测的需要。0.01～8.00mmol/L的检测线性范围，与国外的试剂相比，具有更宽的线性范围，能够保证高值样本准确的检测。从稳定性试验来看，该方法在该试剂在37℃和开口4℃中均能够保证很好的稳定性，解决了保存的问题，表明在方法的试剂在市场应用中具有很好的前景。我们研究使用NBT作为显色剂的D-3羟丁酸试剂盒相比现有的试剂盒拥有更好的线性范围和稳定性，而准确性与国外的试剂盒比较也有很好的相关。实验结果表明选用NBT作为显色剂的该检测方法具有很好的前景，是一种适用于临床的值得推广的方法。
[参考文献]
[1] Baena MG，Cayón M，Ortego-Rojo J，et al. Diabetic ketoacidosis associated with severe hypog- lycemia[J]. J Endocrinol Invest，2010，33（5）：358-359.
[2] Minuto N，Tambroni B，Vannati M，et al. Ketoacidosis caused by exposure of insulin to low temperature[J].Diabetes Technol Ther，2010，2（9）：745-746.
[3] Tsai YC，Liao TH，Lee JA. Identification of L-3-hydroxybutyrate as an original ketone body in rat serum by column-switching high-performance liquid chromatography and fluorescence derivatization[J].Anal Biochem，2003，319（1）：34-41.
[4] Yamamoto T，Iwai M，Kimura S，et al. The mechanism of action of hepatic sympathetic nerves on ketone-body output from perfused rat liver. The effect of the interaction of noradrenaline with ATP on the release of beta-hydroxybutyrate[J]. Eur J Biochem，1995，234（2）：466-471.
[5] Hassan HM，Cooper GA. Determination of beta-hydroxybutyrate in blood and urine using gas chromatography- mass spectrometry[J].J Anal Toxicol，2009，33（8）：502-507.
[6] Hoque MM，Shimizu S，Hossain MT，et al. The structures of Alcaligenes faecalis D-3-hydroxybutyrate dehydrogenase before and after NAD+ and acetate binding suggest a dynamical reaction mechanism as a member of the SDR family[J]. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr，2008，64（5）：496-505.
[7] EP05-A.Evaluation of precision performance of clinical chemistry devices；Approved Guide- line[S].NCCLS （http：//www.NCCLS.org）.
[8] EP06-A.Evaluation of the linearity of quantitative analytical methods：Approved Guideline[S].NCCLS（http：//www.NCCLS.org）.
[9] EP07-A.Interference testing in clinical chemistry；Proposed Guideline[S].NCCLS（http：//www.NCCLS.org）.
[10] 胡荣盛，邱彬，朱振坤.血清β-羟丁酸酶法测定的方法学和临床应用评价[J].江西医学检验，2007，25 （4）： 335-337.
[11] 钟延法.联合检测血糖、糖化血清蛋白、D-3羟丁酸在糖尿病中的应用价值[J].中国医药导刊，2013，15 （21）：191-192.
[12] 王小平.全自动生化仪可比性分析[J].检验医学与临床，2013，10（3）： 279-280，282.
（收稿日期：2014-04-24）