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摘 要：本文采用高校液相测定了黄连上清片中栀子苷的含量，固定相为：安捷伦Cl8（4.6mm×250mm，5um），乙腈-甲醇-水（10：5∶85）为流动相，检测波长为238nm，流速1.0mL·min-1，柱温：30℃。栀子苷在10～120μg·mL-1范围内呈良好的线性关系。栀子苷的平均回收率为99.2%，RSD为0.91%（n=6）；此方法简便、准确、重现性好，可用于黄连上清片中栀子苷的含量测定。
关键词：黄连上清片；栀子苷；含量
黄连上清片具有清热通便，散风止痛的功效。黄连上清片常用于内热火盛引起的头晕脑胀、大便干燥、牙龈肿痛、咽喉红肿、耳痛耳鸣、口舌生疮、暴发火眼等。黄连上清片由黄连、大黄、栀子（姜制）、黄芩、菊花、连翘、蔓荆子（炒）、荆芥穗、薄荷、黄柏（酒炒）、防风、旋覆花、石膏、桔梗、白芷、甘草、川芎组成。栀子别名：黄栀子、山栀、白蟾，是茜草科植物栀子的果实。栀子具有护肝、镇静、止血、利胆、降压、消肿等作用。栀子常用于治疗黄疸型肝炎、扭挫伤、高血压、糖尿病等症。《药性赋》记载：“味苦，性大寒，无毒。沉也，阴也。其用有二：疗心中懊憹颠倒而不得眠，治脐下血滞小便而不得利。易老云：轻飘而象肺，色赤而象火，又能泻肿中之火。”栀子含有环烯醚萜、二萜、三萜、黄酮、有机酸酯、挥发油、多糖及各种微量元素，具有利胆、保肝、降压、降脂、降血糖、抗菌、消炎等丰富的药理活性[1-4]。本文采用高校液相测定了黄连上清片中栀子苷的含量。
1 仪器与试药
美国必能信超声波清洗机（北京星越天成科技有限公司）；色谱柱温箱（北京国谱科技有限公司）；Aurora-F1实验室自动洗瓶机（杭州喜瓶者生物技术有限公司）；LC600A梯度液相色谱仪（南京科捷分析仪器有限公司）；WIGGENS AVANT经济型超声波清洗器（北京桑翌实验仪器研究所）；FA1204CFAC型全自動內校電子分析天平（北京同德创业科技有限公司）；便携式PH计（北京恒奥德仪器仪表有限公司）；SYZ-B石英亚沸蒸馏水器（常州市精达仪器制造有限公司）；HH-601超级恒温水浴锅（常州市华怡仪器制造有限公司）；GQ-722型数显分光光度计（南京固琦分析仪器制造有限公司）。栀子苷对照品由中国药品生物制品检定所提供。乙腈（上海拜力生物科技有限公司）、三乙胺（广州市西陇化工有限公司）、甲醇（上海拜力生物科技有限公司）、冰醋酸（北京迪科马科技有限公司）、磷酸（北京迪科马科技有限公司）、醋酸钠（北京亚太龙兴化工有限公司）。
2 含量测定
2.1 色谱条件：依据查阅文献及考查的结果，确定色谱条件如下[5]。色谱柱为安捷伦Cl8规格为（4.6mm×250mm，5um）；乙腈-甲醇-水（10：5：85）为流动相；检测波长为238nm。理论板数按栀子苷峰计算应不得低于2000。
2.2 供試品溶液的制备
取黄连上清片，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加人甲醇50ml，称定重量，超声处理5分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。
2.3 对照品溶液的制备
精密称取栀子苷对照品约5mg，用甲醇溶解并稀释成每1ml中含20？g的溶液，作为对照溶液。
2.4 阴性溶液的制备
依照处方取黄连、大黄、黄芩、菊花、连翘、蔓荆子、荆芥穗、薄荷、黄柏、防风、旋覆花、石膏、桔梗、白芷、甘草、川芎药材，按样品制备工艺制成阴性对照样品，照供试品溶液的制备方法制成阴性液，依上述方法测定，结果在栀子苷出峰处阴性液无色谱峰，结果阴性试验没有干扰，表明本方法专属性良好。
2.5 准曲线的制备
制备浓度为10、20、40、60、80、100、120μg·mL-1的对照品溶液，分别精密吸取10μL注入HPLC，记录色谱图。以峰面积积分值A（μg）为横坐标，进样量为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。试验表明，栀子苷对照品在10～120μg·mL-1范围内线性关系良好。
2.6 精密度试验
依照2.4项下制备对照品溶液，精密吸取栀子苷对照品溶液10μL重复进样6次，测定峰面积积分值，对照品峰面积积分值的RSD为0.81%。结果表明，本实验精密度良好。
2.7 重现性试验
分别称取同批黄连上清片样品6份，分别依照2.3项下供试品制0.82%，结果表明，此含量测定方法的重现性良好。
2.8 稳定性试验
依照2.3项下供试品制备方法制备供试品溶液，分别在0，2，4，6小时精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，进样测定，供试品栀子苷峰面积积分值的RSD为0.73%。结果表明栀子苷至少在6小时内稳定。
2.9 回收率试验
采用加样回收试验，取已知含量的同一批供试品各6份，精密称定，分精密添加一定量的栀子苷对照品，按供试品制备所述方法制备供试品溶液，测定含量（同时测定样品含量），计算回收率。6次测定的平均回收率为99.2%，RSD为0.91%。
2.10 样品含量测定
依照上述含量测定方法，测定黄连上清片三批样品中栀子苷的含量，含量为3.56mg/g、3.62mg/g、3.62mg/g。
3 讨论
分别考察乙腈-水（35：65），乙腈-甲醇-水（10：5：85），水-乙腈-三乙胺（82∶18：0.01），甲醇-水-冰醋酸（20∶80∶1），甲醇：水：冰醋酸：三乙胺（30：70：0.03：0.06），乙腈-0.2%磷酸水溶液（13∶87），乙腈-水（9∶91），乙腈-1%冰醋酸溶液（20∶80）不同比例的流动相，结果以乙腈-甲醇-水（10：5：85）为流动相，供试品各峰分离效果最好，故选用乙腈-甲醇-水（10：5：85）为流动相。此方法简便、准确、重现性好，可用于黄连上清片中栀子苷的含量测定。黄连上清片中栀子苷的含量不少于3.0mg/g。
参考文献
[1]时宇静，黄洋，郭姗姗，姜晶，苏丹，赵晔，高英杰，崔晓兰.栀子提取物对单纯疱疹病毒1型感染小鼠VP16mRNA和IFN-γmRNA的影响[J].病毒学报，2009（01）.
[2]周峻伟.栀子苷、黄芩苷对大鼠局灶性脑缺血模型缺血脑组织单核细胞趋化蛋白（MCP-1）的影响[J].中医药学刊，2004（06）.
[3]张立明，何开泽，任治军，蒲蔷.栀子中京尼平甙对CCl4急性小鼠肝损伤保护作用的生化机理研究（英文）[J].应用与环境生物学报，2005（06）.
[4]丁嵩涛，刘洪涛，李文明，李秀英，于超.栀子苷对氧化应激损伤血管内皮细胞的保护作用[J].中国药理学通报，2009（06）.
[5]胡开治，刘燕琴，秦剑，张军，秦静，刘杰.重庆产栀子的栀子苷含量分布规律研究[J].西南大学学报（自然科学版），2010（08）.
关键词：黄连上清片；栀子苷；含量
黄连上清片具有清热通便，散风止痛的功效。黄连上清片常用于内热火盛引起的头晕脑胀、大便干燥、牙龈肿痛、咽喉红肿、耳痛耳鸣、口舌生疮、暴发火眼等。黄连上清片由黄连、大黄、栀子（姜制）、黄芩、菊花、连翘、蔓荆子（炒）、荆芥穗、薄荷、黄柏（酒炒）、防风、旋覆花、石膏、桔梗、白芷、甘草、川芎组成。栀子别名：黄栀子、山栀、白蟾，是茜草科植物栀子的果实。栀子具有护肝、镇静、止血、利胆、降压、消肿等作用。栀子常用于治疗黄疸型肝炎、扭挫伤、高血压、糖尿病等症。《药性赋》记载：“味苦，性大寒，无毒。沉也，阴也。其用有二：疗心中懊憹颠倒而不得眠，治脐下血滞小便而不得利。易老云：轻飘而象肺，色赤而象火，又能泻肿中之火。”栀子含有环烯醚萜、二萜、三萜、黄酮、有机酸酯、挥发油、多糖及各种微量元素，具有利胆、保肝、降压、降脂、降血糖、抗菌、消炎等丰富的药理活性[1-4]。本文采用高校液相测定了黄连上清片中栀子苷的含量。
1 仪器与试药
美国必能信超声波清洗机（北京星越天成科技有限公司）；色谱柱温箱（北京国谱科技有限公司）；Aurora-F1实验室自动洗瓶机（杭州喜瓶者生物技术有限公司）；LC600A梯度液相色谱仪（南京科捷分析仪器有限公司）；WIGGENS AVANT经济型超声波清洗器（北京桑翌实验仪器研究所）；FA1204CFAC型全自動內校電子分析天平（北京同德创业科技有限公司）；便携式PH计（北京恒奥德仪器仪表有限公司）；SYZ-B石英亚沸蒸馏水器（常州市精达仪器制造有限公司）；HH-601超级恒温水浴锅（常州市华怡仪器制造有限公司）；GQ-722型数显分光光度计（南京固琦分析仪器制造有限公司）。栀子苷对照品由中国药品生物制品检定所提供。乙腈（上海拜力生物科技有限公司）、三乙胺（广州市西陇化工有限公司）、甲醇（上海拜力生物科技有限公司）、冰醋酸（北京迪科马科技有限公司）、磷酸（北京迪科马科技有限公司）、醋酸钠（北京亚太龙兴化工有限公司）。
2 含量测定
2.1 色谱条件：依据查阅文献及考查的结果，确定色谱条件如下[5]。色谱柱为安捷伦Cl8规格为（4.6mm×250mm，5um）；乙腈-甲醇-水（10：5：85）为流动相；检测波长为238nm。理论板数按栀子苷峰计算应不得低于2000。
2.2 供試品溶液的制备
取黄连上清片，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加人甲醇50ml，称定重量，超声处理5分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。
2.3 对照品溶液的制备
精密称取栀子苷对照品约5mg，用甲醇溶解并稀释成每1ml中含20？g的溶液，作为对照溶液。
2.4 阴性溶液的制备
依照处方取黄连、大黄、黄芩、菊花、连翘、蔓荆子、荆芥穗、薄荷、黄柏、防风、旋覆花、石膏、桔梗、白芷、甘草、川芎药材，按样品制备工艺制成阴性对照样品，照供试品溶液的制备方法制成阴性液，依上述方法测定，结果在栀子苷出峰处阴性液无色谱峰，结果阴性试验没有干扰，表明本方法专属性良好。
2.5 准曲线的制备
制备浓度为10、20、40、60、80、100、120μg·mL-1的对照品溶液，分别精密吸取10μL注入HPLC，记录色谱图。以峰面积积分值A（μg）为横坐标，进样量为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。试验表明，栀子苷对照品在10～120μg·mL-1范围内线性关系良好。
2.6 精密度试验
依照2.4项下制备对照品溶液，精密吸取栀子苷对照品溶液10μL重复进样6次，测定峰面积积分值，对照品峰面积积分值的RSD为0.81%。结果表明，本实验精密度良好。
2.7 重现性试验
分别称取同批黄连上清片样品6份，分别依照2.3项下供试品制0.82%，结果表明，此含量测定方法的重现性良好。
2.8 稳定性试验
依照2.3项下供试品制备方法制备供试品溶液，分别在0，2，4，6小时精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，进样测定，供试品栀子苷峰面积积分值的RSD为0.73%。结果表明栀子苷至少在6小时内稳定。
2.9 回收率试验
采用加样回收试验，取已知含量的同一批供试品各6份，精密称定，分精密添加一定量的栀子苷对照品，按供试品制备所述方法制备供试品溶液，测定含量（同时测定样品含量），计算回收率。6次测定的平均回收率为99.2%，RSD为0.91%。
2.10 样品含量测定
依照上述含量测定方法，测定黄连上清片三批样品中栀子苷的含量，含量为3.56mg/g、3.62mg/g、3.62mg/g。
3 讨论
分别考察乙腈-水（35：65），乙腈-甲醇-水（10：5：85），水-乙腈-三乙胺（82∶18：0.01），甲醇-水-冰醋酸（20∶80∶1），甲醇：水：冰醋酸：三乙胺（30：70：0.03：0.06），乙腈-0.2%磷酸水溶液（13∶87），乙腈-水（9∶91），乙腈-1%冰醋酸溶液（20∶80）不同比例的流动相，结果以乙腈-甲醇-水（10：5：85）为流动相，供试品各峰分离效果最好，故选用乙腈-甲醇-水（10：5：85）为流动相。此方法简便、准确、重现性好，可用于黄连上清片中栀子苷的含量测定。黄连上清片中栀子苷的含量不少于3.0mg/g。
参考文献
[1]时宇静，黄洋，郭姗姗，姜晶，苏丹，赵晔，高英杰，崔晓兰.栀子提取物对单纯疱疹病毒1型感染小鼠VP16mRNA和IFN-γmRNA的影响[J].病毒学报，2009（01）.
[2]周峻伟.栀子苷、黄芩苷对大鼠局灶性脑缺血模型缺血脑组织单核细胞趋化蛋白（MCP-1）的影响[J].中医药学刊，2004（06）.
[3]张立明，何开泽，任治军，蒲蔷.栀子中京尼平甙对CCl4急性小鼠肝损伤保护作用的生化机理研究（英文）[J].应用与环境生物学报，2005（06）.
[4]丁嵩涛，刘洪涛，李文明，李秀英，于超.栀子苷对氧化应激损伤血管内皮细胞的保护作用[J].中国药理学通报，2009（06）.
[5]胡开治，刘燕琴，秦剑，张军，秦静，刘杰.重庆产栀子的栀子苷含量分布规律研究[J].西南大学学报（自然科学版），2010（08）.