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关键词：产纤维素酶细菌;FPA酶;CMC酶;发酵条件优化
能源、环境及工农业原料生产等问题越来越影响着人们的日常生活，高产纤维素酶微生物的筛选对解决这些问题都十分重要[1-3]。大多数细菌所产纤维素酶与真菌来源的酶性质不同，某些方面具有真菌酶不可替代的作用[4]。細菌纤维素酶在饲料工业、洗涤剂工业及纺织工业中具有广泛的利用前景，因此在工业生产中的地位逐渐提高[5]，其中产纤维素酶的芽孢杆菌成为近年来的研究热点[6]。本试验以从白酒酒醅中选育得到的产纤维素酶细菌菌株DM-4为试验菌株，利用单因素试验和响应面试验设计，优化其发酵产酶条件，为进一步的试验研究准备条件。
1 材料与方法
1.1 试验菌株
菌株DM-4，由笔者所在实验室从白酒酒醅中选育得到，经鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。
1.2 培养基
种子培养基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，pH值7.5～7.6，121 ℃下灭菌30 min。发酵培养基：CMC-Na 10 g，蛋白胨2.5 g，酵母浸出汁 1.0 g，NaCl 2.5 g，KH2PO3 0.5 g，硫酸镁0.1 g，琼脂10 g，去离子水500 mL，121 ℃下灭菌30 min。
1.3 纤维素酶活力测定方法
待测发酵液倒入离心管中，5 000 r/min离心 10 min，取上清液测定酶活。滤纸酶（FPA酶）活力测定：根据国际理论应用化学协会（IUPAC）的方法测定[7]。CMC酶活力测定见参考文献[8]。
1.4 菌株液体发酵产酶条件的优化
1.4.1 发酵时间的确定 发酵培养基内接入种子后，从12 h开始，每12 h取样测定酶活，直到72 h。
1.4.2 接种量的确定 按照1%、2%、3%、4%、5%和6%的接种量将种子液接入发酵培养基中，于37 ℃、摇瓶转速200 r/min的条件下发酵36 h后测酶活力。
1.4.3 培养基成分的优化
1.4.3.1 碳源的优化 （1）碳源种类的优化：以羧甲基纤维素钠（CMC-Na）、麸皮（过80目筛）、玉米粉、葡萄糖、蔗糖、淀粉和微晶纤维素作为唯一碳源（2%）配制培养基，接入种子后发酵36 h后测酶活力。（2）碳源浓度的优化：在优化碳源种类后，配制碳源浓度为0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、35%和4%的发酵培养基，接入突变菌株发酵36 h后测酶活力。
1.4.3.2 氮源的优化 （1）氮源种类的优化：优化碳源后，以蛋白胨、豆饼粉（过80目筛）、大豆蛋白粉、硫酸铵、硝酸钾和尿素作为唯一氮源（0.5%）配制发酵培养基，接入种子后发酵36 h后测酶活力。（2）氮源浓度的优化：在优化氮源种类后，配制优化氮源浓度为0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%和11%发酵培养基，接入种子后发酵36 h后测酶活力。
1.4.3.3 初始pH值的优化 分别配制pH值4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0碳氮源优化后发酵培养基，接入突变菌株发酵36 h后测酶活力。
1.4.3.4 磷酸盐浓度优化 配制K2HPO3浓度为01%、0.5%、0.9%、1.3%和1.7%的上述条件优化后的发酵培养基，接入突变菌株发酵36 h后测酶活力。
1.4.4 响应面设计试验 在上述优化基础上，根据Box-Behuken设计方法，采用minitab 16构建3因素（碳源浓度、氮源浓度和磷酸盐浓度）3水平响应面分析[9-10]。
1.4.5 统计分析 利用SPASS软件实现统计分析及差异显著性检验[11]。
2 结果与分析
2.1 发酵时间的确定
接入种子液后，从发酵12 h开始每隔12 h测定FPA酶活和CMC酶活，直到发酵后72 h，结果如图1所示。发酵时间为36 h时，菌株产FPA酶和CMC酶都表现出了比较高的酶活力，继续发酵到48 h会有少许增加，之后逐渐下降。经差异显著性检验，发酵36 h酶活与发酵48 h酶活差异不显著（P
能源、环境及工农业原料生产等问题越来越影响着人们的日常生活，高产纤维素酶微生物的筛选对解决这些问题都十分重要[1-3]。大多数细菌所产纤维素酶与真菌来源的酶性质不同，某些方面具有真菌酶不可替代的作用[4]。細菌纤维素酶在饲料工业、洗涤剂工业及纺织工业中具有广泛的利用前景，因此在工业生产中的地位逐渐提高[5]，其中产纤维素酶的芽孢杆菌成为近年来的研究热点[6]。本试验以从白酒酒醅中选育得到的产纤维素酶细菌菌株DM-4为试验菌株，利用单因素试验和响应面试验设计，优化其发酵产酶条件，为进一步的试验研究准备条件。
1 材料与方法
1.1 试验菌株
菌株DM-4，由笔者所在实验室从白酒酒醅中选育得到，经鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。
1.2 培养基
种子培养基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，pH值7.5～7.6，121 ℃下灭菌30 min。发酵培养基：CMC-Na 10 g，蛋白胨2.5 g，酵母浸出汁 1.0 g，NaCl 2.5 g，KH2PO3 0.5 g，硫酸镁0.1 g，琼脂10 g，去离子水500 mL，121 ℃下灭菌30 min。
1.3 纤维素酶活力测定方法
待测发酵液倒入离心管中，5 000 r/min离心 10 min，取上清液测定酶活。滤纸酶（FPA酶）活力测定：根据国际理论应用化学协会（IUPAC）的方法测定[7]。CMC酶活力测定见参考文献[8]。
1.4 菌株液体发酵产酶条件的优化
1.4.1 发酵时间的确定 发酵培养基内接入种子后，从12 h开始，每12 h取样测定酶活，直到72 h。
1.4.2 接种量的确定 按照1%、2%、3%、4%、5%和6%的接种量将种子液接入发酵培养基中，于37 ℃、摇瓶转速200 r/min的条件下发酵36 h后测酶活力。
1.4.3 培养基成分的优化
1.4.3.1 碳源的优化 （1）碳源种类的优化：以羧甲基纤维素钠（CMC-Na）、麸皮（过80目筛）、玉米粉、葡萄糖、蔗糖、淀粉和微晶纤维素作为唯一碳源（2%）配制培养基，接入种子后发酵36 h后测酶活力。（2）碳源浓度的优化：在优化碳源种类后，配制碳源浓度为0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、35%和4%的发酵培养基，接入突变菌株发酵36 h后测酶活力。
1.4.3.2 氮源的优化 （1）氮源种类的优化：优化碳源后，以蛋白胨、豆饼粉（过80目筛）、大豆蛋白粉、硫酸铵、硝酸钾和尿素作为唯一氮源（0.5%）配制发酵培养基，接入种子后发酵36 h后测酶活力。（2）氮源浓度的优化：在优化氮源种类后，配制优化氮源浓度为0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%和11%发酵培养基，接入种子后发酵36 h后测酶活力。
1.4.3.3 初始pH值的优化 分别配制pH值4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0碳氮源优化后发酵培养基，接入突变菌株发酵36 h后测酶活力。
1.4.3.4 磷酸盐浓度优化 配制K2HPO3浓度为01%、0.5%、0.9%、1.3%和1.7%的上述条件优化后的发酵培养基，接入突变菌株发酵36 h后测酶活力。
1.4.4 响应面设计试验 在上述优化基础上，根据Box-Behuken设计方法，采用minitab 16构建3因素（碳源浓度、氮源浓度和磷酸盐浓度）3水平响应面分析[9-10]。
1.4.5 统计分析 利用SPASS软件实现统计分析及差异显著性检验[11]。
2 结果与分析
2.1 发酵时间的确定
接入种子液后，从发酵12 h开始每隔12 h测定FPA酶活和CMC酶活，直到发酵后72 h，结果如图1所示。发酵时间为36 h时，菌株产FPA酶和CMC酶都表现出了比较高的酶活力，继续发酵到48 h会有少许增加，之后逐渐下降。经差异显著性检验，发酵36 h酶活与发酵48 h酶活差异不显著（P