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【摘 要】目的：对BSL-2 实验室安全性进行评估，讨论检测生物安全二级（ BSL-2） 实验室结核分枝杆菌（ MTB） 的污染情况。方法：采集物体表面样本用物表采样规格板和棉拭子。采集MTB 检验前、中、后的空气样本，用FA-2 型撞击式空气微生物采样器，收集于血平板和生理盐水采样介质。接种改良MTB 液体培养基和罗氏中性培养基培养MTB。结果：未见分枝杆菌生长改良罗氏中性培养基，经测序证实属于MTB 复合群和脓肿分枝杆菌的有液体培养基检出的3例分枝杆菌；MTB 核酸阳性有3%的样本，都属于进行药敏试验的2个BSL-2 实验室； 样本平皿菌落量来自生物安全柜的血平板采样的达2 + 或以上有25.7%。结论：总的来说受检医院BSL-2 实验室MTB 污染的状况可控制，但应重点加强生物安全防护在进行MTB药敏试验的实验室方面。
【关键词】结核分枝杆菌；生物安全二级实验室
【中图分类号】R446.5 【文献标识码】A 【文章编号】1004—7484（2013）11—0051—02
前言
我国数居世界第2位在活动性肺结核患者中，全国受到了MTB 感染约5.5亿人。世界卫生组织报道，2009 年全球新发結核患者约900 万，约有170 万人死于结核病。结核病已成为全世界因传染病而死亡的成人主要疾病之一[1]。结核病是严重危害人类健康的慢性传染病，是当今对人类全球范围最具有威胁性的疾病之一，是由结核分枝杆菌感染引起的传染性疾病。已经成为当今结核病控制所面临的三大难题的是耐药、流动人口和HIV感染，近年来发病率呈上升趋势的是获得性免疫缺乏综合征—即艾滋病AIDS，而AIDS患者又极易患结核病，因此，再次成为威胁人类健康的主要传染病的是结核病。越来越受关注在实验室生物安全问题中，可导致病原体泄露到周围环境中造成严重后果或感染实验室工作人员如果忽视生物安全，全世界生物医学实验室共同关注的问题是生物安全。因此，对实验室生物安全工作具有借鉴意义的是要评价发生实验室污染的关键环节，检测和监测MTB实验活动中实验室环境的污染。
1 资料和方法
1.1 资料
选择本市具有代表性的，具进行病原菌培养、结核病筛查及治疗资质的17家医院的BSL-2 实验室。实验室按照标准化操作程序进行相关MTB 操作。
1.2 方法
使用采样规格板采样，用生理盐水湿润棉签，每采样一次用75% 的酒精擦规格板；将采样棉签放入50 mL 离心管中密闭；用FA-2 型撞击式空气微生物采样器，收集悬浮在空气中的微生物粒子，放在采样介质表面上；采样流量为27.3 L /min，采样时间约为20 min； 采集实验前后实验准备间、实验区、生物安全柜的空气样本，多数实验室未分出独立的实验准备间，进行空气采样在实验人员进行涂片、离心、接种操作过程中。分别小心将采样棉签上的液体挤出用高压灭菌后的镊子； 将平皿中的生理盐水收集到无菌50 mL 离心管中，轻轻摇晃使生理盐水接触整个平皿底部。进行MTB 培养和核酸检测用NALC /NaOH处理后。血平板划线纯化菌落，16S rRNA 鉴定挑选所需鉴定的菌种，观察菌落生长情况 2 d 后。添加500 μL 的生理盐水在1.5 mL EP 管中，挑取单个纯化的菌落至EP 管中，震荡混匀。放置到95 ℃金属浴中20 min将EP 管，取上清作为核酸模板。13 000 r /min 离心10 min。
1.3 评估方法
每3天观察1次中性罗氏培养基，若有疑似污染，镜检并在涂片后进行抗酸染色及革兰染色， 若有疑似MTB 菌落生长形成，则镜检判断是否为抗酸杆菌，做抗酸染色涂片后。若仍未见有分枝杆菌生长8 周后，则判定为阴性。每日观察MGIT-960，仪器红色指示灯立即闪亮，阳性样本，确定是否为分枝杆菌的是阳性培养管取出后直接涂片进行抗酸染色； 阴性是仪器绿色指示灯闪亮。
3 讨论
人及动物结核病的病原菌是结核分枝杆菌（TB），发病率最高的是以人型结核分枝杆菌，约占百分之九十，接下来接是牛型，其它分枝杆菌所致感染非常少见。近年来国内有不少有关生物安全防护[2]、生物安全管理、 防护设备调查[3]的实验室生物安全问题发生，越来越引起人们的重视。一般涉及 MTB 生物安全的文献较少，缺乏相应的实验数据支持，主要为说明操作规范的标准操作程序。难以避免产生气溶胶在日常检测 MTB 的实验活动中， 如痰样本混匀、离心、开启培养皿和安瓿，样本涂片、意外事件如培养物的溅出和泼洒、培养液的倾倒和转移、离心管破碎等都可造成严重污染。主要原因是因为大部分实验室感染人员在处理临床样本和培养物过程中吸入产生的含病原体的气溶胶所致。医务人员存在较高的感染风险，在结核病患者较多活动的医疗卫生单位。结核防治工作人员结核病发病水平显著高于一般人群，因此，对于预防实验室感染具有重要意义的是检测和监测 MTB 实验活动中实验室环境的污染，评价发生实验室感染环节。在 BSL- 2 实验室空气中采集的大部分实验室的生物安全柜中存在普通环境微生物的相当量的微生物， 主要为芽孢杆菌属、葡萄球菌属， 这可能会造成检测结果的不准确，给日常样本带来污染，应加强消毒措施。
近年来在结核分枝杆菌细菌学方法和免疫学、分子生物学方面都取得了许多进展，将会给结核病临床诊断提供更快速、特异、敏感的诊断方法，在分子生物学检测技术技术及快速培养更广泛的应用，以及方法不但完善与改进方面。总之， 本市 BSL- 2 实验室 MTB 的污染状况对实验室和环境不会造成污染，总体可控。但应加强进行 MTB 药物敏感性试验的实验室和日常消毒灭菌工作，应重点加强生物安全防护工作。
参考文献：
[1] World Health Organization. WHO report 2010 globalTB control [EB/OL]. http： / /www. who. int /tb /publications/global_report /2010/en/index. html，2010-10-15 /2011-03-15.
[2] 吴朝阳， 谭穗茹， 吴琼谊. 医院检验科感染性气溶胶的产生及生物安全防护[ J].职业与健康， 2008，24（3）：217.
[3] 陆龙喜，林军明，顾华. 生物安全实验室中生物安全柜使用现状调查[J].中国消毒学杂志， 2010，27（4）：376- 378.
【关键词】结核分枝杆菌；生物安全二级实验室
【中图分类号】R446.5 【文献标识码】A 【文章编号】1004—7484（2013）11—0051—02
前言
我国数居世界第2位在活动性肺结核患者中，全国受到了MTB 感染约5.5亿人。世界卫生组织报道，2009 年全球新发結核患者约900 万，约有170 万人死于结核病。结核病已成为全世界因传染病而死亡的成人主要疾病之一[1]。结核病是严重危害人类健康的慢性传染病，是当今对人类全球范围最具有威胁性的疾病之一，是由结核分枝杆菌感染引起的传染性疾病。已经成为当今结核病控制所面临的三大难题的是耐药、流动人口和HIV感染，近年来发病率呈上升趋势的是获得性免疫缺乏综合征—即艾滋病AIDS，而AIDS患者又极易患结核病，因此，再次成为威胁人类健康的主要传染病的是结核病。越来越受关注在实验室生物安全问题中，可导致病原体泄露到周围环境中造成严重后果或感染实验室工作人员如果忽视生物安全，全世界生物医学实验室共同关注的问题是生物安全。因此，对实验室生物安全工作具有借鉴意义的是要评价发生实验室污染的关键环节，检测和监测MTB实验活动中实验室环境的污染。
1 资料和方法
1.1 资料
选择本市具有代表性的，具进行病原菌培养、结核病筛查及治疗资质的17家医院的BSL-2 实验室。实验室按照标准化操作程序进行相关MTB 操作。
1.2 方法
使用采样规格板采样，用生理盐水湿润棉签，每采样一次用75% 的酒精擦规格板；将采样棉签放入50 mL 离心管中密闭；用FA-2 型撞击式空气微生物采样器，收集悬浮在空气中的微生物粒子，放在采样介质表面上；采样流量为27.3 L /min，采样时间约为20 min； 采集实验前后实验准备间、实验区、生物安全柜的空气样本，多数实验室未分出独立的实验准备间，进行空气采样在实验人员进行涂片、离心、接种操作过程中。分别小心将采样棉签上的液体挤出用高压灭菌后的镊子； 将平皿中的生理盐水收集到无菌50 mL 离心管中，轻轻摇晃使生理盐水接触整个平皿底部。进行MTB 培养和核酸检测用NALC /NaOH处理后。血平板划线纯化菌落，16S rRNA 鉴定挑选所需鉴定的菌种，观察菌落生长情况 2 d 后。添加500 μL 的生理盐水在1.5 mL EP 管中，挑取单个纯化的菌落至EP 管中，震荡混匀。放置到95 ℃金属浴中20 min将EP 管，取上清作为核酸模板。13 000 r /min 离心10 min。
1.3 评估方法
每3天观察1次中性罗氏培养基，若有疑似污染，镜检并在涂片后进行抗酸染色及革兰染色， 若有疑似MTB 菌落生长形成，则镜检判断是否为抗酸杆菌，做抗酸染色涂片后。若仍未见有分枝杆菌生长8 周后，则判定为阴性。每日观察MGIT-960，仪器红色指示灯立即闪亮，阳性样本，确定是否为分枝杆菌的是阳性培养管取出后直接涂片进行抗酸染色； 阴性是仪器绿色指示灯闪亮。
3 讨论
人及动物结核病的病原菌是结核分枝杆菌（TB），发病率最高的是以人型结核分枝杆菌，约占百分之九十，接下来接是牛型，其它分枝杆菌所致感染非常少见。近年来国内有不少有关生物安全防护[2]、生物安全管理、 防护设备调查[3]的实验室生物安全问题发生，越来越引起人们的重视。一般涉及 MTB 生物安全的文献较少，缺乏相应的实验数据支持，主要为说明操作规范的标准操作程序。难以避免产生气溶胶在日常检测 MTB 的实验活动中， 如痰样本混匀、离心、开启培养皿和安瓿，样本涂片、意外事件如培养物的溅出和泼洒、培养液的倾倒和转移、离心管破碎等都可造成严重污染。主要原因是因为大部分实验室感染人员在处理临床样本和培养物过程中吸入产生的含病原体的气溶胶所致。医务人员存在较高的感染风险，在结核病患者较多活动的医疗卫生单位。结核防治工作人员结核病发病水平显著高于一般人群，因此，对于预防实验室感染具有重要意义的是检测和监测 MTB 实验活动中实验室环境的污染，评价发生实验室感染环节。在 BSL- 2 实验室空气中采集的大部分实验室的生物安全柜中存在普通环境微生物的相当量的微生物， 主要为芽孢杆菌属、葡萄球菌属， 这可能会造成检测结果的不准确，给日常样本带来污染，应加强消毒措施。
近年来在结核分枝杆菌细菌学方法和免疫学、分子生物学方面都取得了许多进展，将会给结核病临床诊断提供更快速、特异、敏感的诊断方法，在分子生物学检测技术技术及快速培养更广泛的应用，以及方法不但完善与改进方面。总之， 本市 BSL- 2 实验室 MTB 的污染状况对实验室和环境不会造成污染，总体可控。但应加强进行 MTB 药物敏感性试验的实验室和日常消毒灭菌工作，应重点加强生物安全防护工作。
参考文献：
[1] World Health Organization. WHO report 2010 globalTB control [EB/OL]. http： / /www. who. int /tb /publications/global_report /2010/en/index. html，2010-10-15 /2011-03-15.
[2] 吴朝阳， 谭穗茹， 吴琼谊. 医院检验科感染性气溶胶的产生及生物安全防护[ J].职业与健康， 2008，24（3）：217.
[3] 陆龙喜，林军明，顾华. 生物安全实验室中生物安全柜使用现状调查[J].中国消毒学杂志， 2010，27（4）：376- 378.