【摘 要】
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目的 构建稳定表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的弓形虫突变株,探讨以其检测宿主细胞感染率的效果.方法 在人子宫颈癌(HeLa)细胞中培养弓形虫RH株速殖子,电
【机 构】
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江苏大学基础医学与医学技术学院,镇江,212013
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目的 构建稳定表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的弓形虫突变株,探讨以其检测宿主细胞感染率的效果.方法 在人子宫颈癌(HeLa)细胞中培养弓形虫RH株速殖子,电穿孔法向虫体导入质粒ptubP30-GFP/sag-CAT,氯霉素和极限稀释法筛选稳定表达P30-GFP融合蛋白的突变株,RT-PCR法和荧光显微镜检测GFP蛋白在虫体内的表达.HeLa细胞分别感染1×104～1×107个突变株虫体,24h后,显微镜计数各孔10个高倍镜视野下具有GFP荧光的HeLa细胞数.流式细胞仪检测“纳虫泡”,评估HeLa细胞感染率.结果 导入ptubP30-GFP/sag-CAT质粒后,经氯霉素筛选获得阳性克隆.RT-PCR检出虫体GFP基因表达,镜下可见GFP荧光聚集于虫体外膜.HeLa细胞感染率随虫体接种量的增多而增加,接种1×104～1×107个虫体24h后,具有GFP荧光的HeLa细胞数分别为(14±6)、( 133±45)、(332±93)和(443±90)个；流式细胞仪检测HeLa细胞感染率分别为(0.49±0.09)％、(8.76±0.50)％、(21.02±1.49)％和(39.00±3.47)％.结论 构建了刚地弓形虫GFP荧光蛋白突变株,为检测虫体在宿主细胞内的增殖提供了新途径.
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