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【摘要】目的： 探讨HIF-1α、AQP-1表达对口腔鳞癌血管生成的作用 方法： 应用免疫组织化学方法检测口腔鳞状细胞癌36例中HIF-1α、AQP1的表达,利用CD105标记肿瘤微血管密度。结果：HIF-1α在口腔癌中的阳性表达率为50%，表达水平与分化程度明显相关（ p<0.05），与临床分期、肿瘤体积、淋巴结转移无明显相关（p>0.05）；AQP1在子口腔鳞癌中的表达率为87.1%，表达水平与肿瘤体积、临床分期明显相关（p<0.05和p<0.001），与分化程度、淋巴结转移、浸润深度之间无明显相关（p>0.05）；HIF-1α表达水平与微血管密度之间存在明显相关（p<0.05），AQP1表达水平与微血管密度之间不存在明显相关（p>0.05）；微血管密度与肿瘤体积存在明显相关（p<0.05），与临床分期、分化程度、淋巴结转移之间无明显相关（p>0.05）；AQP-1的表达水平与微血管密度之间不存在明显相关（p>0.05）；HIF-1α的表达水平与微血管密度之间存在明显相关（ p<0.05）；AQP-1的表达水平与HIF-1α的表达水平之间存在明显相关（p<0.05）。结论：口腔鳞癌缺氧诱导血管化与肿瘤发展密切相关，HIF-1α、AQP-1均参与肿瘤血管化过程，其中HIF-1α发挥重要作用。
【关键词】口腔鳞癌；AQP-1；HIF-1α；血管新生；缺氧
【中图分类号】R788【文献标识码】A【文章编号】1008-6455（2011）04-0070-01
口腔鳞癌是具有不同程度鳞状分化的侵袭性肿瘤，早期侵袭、广泛淋巴结转移，严重影响治疗手段的选择和预后，而新生血管是浸润转移的结构基础，其结构的不成熟导致肿瘤直接获得营养并便利进入脉管系统，发生血运和淋巴结转移。而肿瘤持续缺氧上调HIF-1水平，进一步激活促血管生成因子，因此缺氧是制约口腔鳞癌浸润的重要环节。水通道蛋白1在许多肿瘤血管内皮过表达，与血管高渗透性密切相关，便利肿瘤获得营养的同时也引起局部组织缺氧，同时启动缺氧诱导因子表达，然而，两者在口腔鳞癌血管生成中相互作用以及协同作用的研究未见报道。本实验利用免疫组化技术检测口腔鳞癌水通道蛋白1和缺氧诱导因子-1的表达，同时计数微血管， 希望能验证我们的推论，并为口腔鳞癌血管新生机制的深入研究和临床抗肿瘤血管治疗提供初步依据。
1 材料与方法
1.1 临床病理资料:收集河北北方学院附属第一医院1998年1月-2005年12月住院患者中临床病理资料齐全的口腔鳞状细胞癌36例，资深病理医师对切片进行复习确诊，年龄38-69岁，平均年龄49岁。基底样鳞状细胞癌18例，疣状癌 9例，梭形细胞癌 9例。未见淋巴结转移15例，可见淋巴结转移21例，肿瘤直径最大5cm，最小2.0cm； TNM分期Ⅰ、Ⅱ期16例，Ⅲ、 Ⅳ期20例。
1.2 免疫组织化学染色:所有标本经10%甲醛常规固定,石蜡包埋,4μm连续切片。AQP-1、HIF-1、CD105一抗试剂均购自北京中山试剂公司。主要免疫组化步骤：二甲苯脱蜡、梯度酒精至水，3%双氧水灭活内源性过氧化酶，PBS缓冲液振洗，专用微波炉进行抗原微波热修复，正常山羊血清封闭、一抗冰箱过夜，二抗 、三抗各1小时，DAB显色10-15分钟，复染核脱水透明，中性树胶封片。结果判断:着色细胞<10%为阴性,>10%为阳性。HIF-1α阳性定位在肿瘤细胞质，、AQP-1、CD105阳性表达定位在内皮细胞胞质。
1.3 数据采集:采用HIPAS100图象分析软件对所有切片进行图象分析，每张切片随机选取10个着色典型区域且不重复的视场，测量每个视场中阳性面积和整张切片面积以及阳性细胞灰度值，阳性表达水平阳性面积/切片面积Х阳性灰度值，取其均数即为该切片的阳性表达水平；根据Weidner标准利用CD105计数肿瘤微血管密度，单个孤立或多个内皮细胞紧密排列均计为一个血管，呈管状即使不连续仅有分支也作为一个血管，肌性厚壁血管、管腔大于50微米的大血管不记数，200倍视野下选择肿瘤组织内血管染色典型区域，400倍视野下计数微血管数目，10个视野的均值计为该切片的微血管密度。
1.3 统计学方法:应用SPSS10.0统计软件进行统计学分析。不同组间表达率的比较采用Fisher精确概率法，各指标在同一组间的表达水平以及与浸润程度之间作直线回归相关分析。以α0.05作为具有统计学意义。
2 结果
HIF-1α在口腔癌中的阳性表达率为50%（18/36），阳性细胞散在于肿瘤组织中，肿瘤中央的阳性细胞比较集中；表达水平与分化程度明显相关（r-0.756p<0.05），与临床分期、肿瘤体积、淋巴结转移无明显相关（p>0.05）。
AQP-1在子口腔癌中的阳性表达率为87.1%（31/36），阳性物质主要表达在血管内皮细胞胞浆，而且位于肿瘤的中心部位的表达较强，而肿瘤外周血管内皮细胞表达较弱；表达水平与肿瘤体积、临床分期明显相关（r0.741p<0.01和r0.875 p<0.001），与分化程度、淋巴结转移、浸润深度之间无明显相关（p<0.05）。
CD105主要表达在肿瘤组织及其周围组织的血管内皮细胞，标记的血管分为窦状扩张型、芽状和细索状、球状血管丛。而且大多数血管内皮较幼稚，体积较大，呈卵圆形，而且基底膜不连续，在肿瘤中央的某些新生血管甚至只见到几个黄染的内皮细胞，未见基底膜样物质围绕。微血管密度与肿瘤体积存在明显相关（r0.856p<0.05），与临床分期、分化程度、淋巴结转移之间无明显相关（p>0.05）
3 讨论
口腔鳞癌是颌面部常见肿瘤，口腔鳞癌倾向于早期浸润和淋巴结转移，不仅影响临床分期，而且直接影响手术效果，甚至导致丧失手术机会，因此有关局部浸润机制研究意义重大。而肿瘤血管新生增加了肿瘤获得营养和淋巴结转移的机会，因此研究肿瘤血管新生意义深远，而肿瘤组织持续缺氧是诱导新生血管生成的关键因子[1、2、3、4、5]。而上述机制的关键环节是缺氧诱导因子的激活。
缺氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor,HIF-1）是在缺氧条件下广泛存在于哺乳动物和人体内的一种转录因子，其活性主要依靠HIF-1α实现，缺氧条件下HIF-1α进入细胞核，结合低氧效应元件，上调大量编码血管生成的蛋白基因表达，因此检测HIF-1α可动态观察组织缺氧状态；同时HIF-1α可调节多种靶基因如血管内皮生长因子，红细胞生成素等的表达，其活性在维持肿瘤细胞的能量代谢、新生血管形成以及促进肿瘤增殖和转移中起重要作用，称为缺氧基因表达的总开关[6、7]。我们的实验结果显示HIF-1α在口腔鳞癌中的阳性表达率分别为50%（18/36），与国外研究中食管癌阳性表达率类似，而明显低于喉癌的阳性表达率，说明不同肿瘤组织耐受缺氧能力具有特异性，而且缺氧调控主要机制存在差异；HIF-1α表达水平与肿瘤分化之间存在相关，Kilic U 等在研究子宫内膜癌时发现，浸润至外肌层的肿瘤细胞高表达HIF-1α，相反浸润内肌层的肿瘤组织表达较弱[9、10]。说明随肿瘤去分化，肿瘤代谢加剧，需氧量增加；肿瘤浸润深度增加，肿瘤内部流体静力学发生变化，血管内压力增加，加剧缺氧，因此导致HIF-1α的高表达，启动以VEGF为主的血管形成因子，在促进肿瘤血管形成中起重要作用。
水跨膜转运是细胞生存和生长的必要条件，水通道蛋白（aquaporinAQPs）是一类高效转运水分子的特异孔道，与水分子的快速跨膜转运密切相关， AQP-1正常在血管内皮细胞浆或膜表达，目前主要对此的研究集中在脑损伤导致的细胞水肿和再灌注等方面。新近研究显示在肿瘤细胞系或细胞株中高表达，提示AQP-1表达与肿瘤高血管渗透性有潜在关系，Ong C 等研究显示AQP-1高表达与骨髓瘤的相关血管生成成正比，与疾病的进展密切相关，推测AQP-1参与肿瘤血管生成[8]。可能通过与VEGF协同作用，增加肿瘤血管的通透性，便利内皮细胞增殖、迁移，而且高渗透性引起血浆外渗，为基底膜样物质形成提供物质条件，同时流体静力压升高，加重缺氧，也激活缺氧诱导因子，导致血管生成[11、12]。本实验AQP-1阳性表达率为为87.1%（31/36），阳性物质主要表达在血管内皮细胞胞浆，而且位于肿瘤的中心部位的表达较强，而肿瘤外周血管内皮细胞表达较弱；说明缺氧严重的中心部位肿瘤细胞缺氧严重，诱导内皮细胞表达AQP-1升高，暂时缓解缺氧带来的代谢及营养障碍；AQP-1的表达水平与肿瘤体积、临床分期明显相关（p<0.05和p<0.001），说明随肿瘤体积的增加、临床分期的进展，肿瘤缺氧更加严重，需氧增加，诱导肿瘤内皮细胞表达AQP-1，通过局部渗透获得营养，刺激内皮细胞增殖分化迁移，进一步生成新血管。同时进一步加重的缺氧也诱导缺氧诱导因子表达，进一步刺激血管生成。
三种指标表达水平之间两两作直线相关分析显示： AQP-1的表达水平与HIF-1α的表达水平之间存在明显相关（r0.648p<0.05），说明AQP-1表达导致局部缺氧在子口腔癌中发挥重要作用，而诱导血管生成作用不明显。HIF-1α的表达水平与微血管密度之间存在明显相关（ p<0.05），说明HIF-1α是刺激血管生成的关键因子。
【关键词】口腔鳞癌；AQP-1；HIF-1α；血管新生；缺氧
【中图分类号】R788【文献标识码】A【文章编号】1008-6455（2011）04-0070-01
口腔鳞癌是具有不同程度鳞状分化的侵袭性肿瘤，早期侵袭、广泛淋巴结转移，严重影响治疗手段的选择和预后，而新生血管是浸润转移的结构基础，其结构的不成熟导致肿瘤直接获得营养并便利进入脉管系统，发生血运和淋巴结转移。而肿瘤持续缺氧上调HIF-1水平，进一步激活促血管生成因子，因此缺氧是制约口腔鳞癌浸润的重要环节。水通道蛋白1在许多肿瘤血管内皮过表达，与血管高渗透性密切相关，便利肿瘤获得营养的同时也引起局部组织缺氧，同时启动缺氧诱导因子表达，然而，两者在口腔鳞癌血管生成中相互作用以及协同作用的研究未见报道。本实验利用免疫组化技术检测口腔鳞癌水通道蛋白1和缺氧诱导因子-1的表达，同时计数微血管， 希望能验证我们的推论，并为口腔鳞癌血管新生机制的深入研究和临床抗肿瘤血管治疗提供初步依据。
1 材料与方法
1.1 临床病理资料:收集河北北方学院附属第一医院1998年1月-2005年12月住院患者中临床病理资料齐全的口腔鳞状细胞癌36例，资深病理医师对切片进行复习确诊，年龄38-69岁，平均年龄49岁。基底样鳞状细胞癌18例，疣状癌 9例，梭形细胞癌 9例。未见淋巴结转移15例，可见淋巴结转移21例，肿瘤直径最大5cm，最小2.0cm； TNM分期Ⅰ、Ⅱ期16例，Ⅲ、 Ⅳ期20例。
1.2 免疫组织化学染色:所有标本经10%甲醛常规固定,石蜡包埋,4μm连续切片。AQP-1、HIF-1、CD105一抗试剂均购自北京中山试剂公司。主要免疫组化步骤：二甲苯脱蜡、梯度酒精至水，3%双氧水灭活内源性过氧化酶，PBS缓冲液振洗，专用微波炉进行抗原微波热修复，正常山羊血清封闭、一抗冰箱过夜，二抗 、三抗各1小时，DAB显色10-15分钟，复染核脱水透明，中性树胶封片。结果判断:着色细胞<10%为阴性,>10%为阳性。HIF-1α阳性定位在肿瘤细胞质，、AQP-1、CD105阳性表达定位在内皮细胞胞质。
1.3 数据采集:采用HIPAS100图象分析软件对所有切片进行图象分析，每张切片随机选取10个着色典型区域且不重复的视场，测量每个视场中阳性面积和整张切片面积以及阳性细胞灰度值，阳性表达水平阳性面积/切片面积Х阳性灰度值，取其均数即为该切片的阳性表达水平；根据Weidner标准利用CD105计数肿瘤微血管密度，单个孤立或多个内皮细胞紧密排列均计为一个血管，呈管状即使不连续仅有分支也作为一个血管，肌性厚壁血管、管腔大于50微米的大血管不记数，200倍视野下选择肿瘤组织内血管染色典型区域，400倍视野下计数微血管数目，10个视野的均值计为该切片的微血管密度。
1.3 统计学方法:应用SPSS10.0统计软件进行统计学分析。不同组间表达率的比较采用Fisher精确概率法，各指标在同一组间的表达水平以及与浸润程度之间作直线回归相关分析。以α0.05作为具有统计学意义。
2 结果
HIF-1α在口腔癌中的阳性表达率为50%（18/36），阳性细胞散在于肿瘤组织中，肿瘤中央的阳性细胞比较集中；表达水平与分化程度明显相关（r-0.756p<0.05），与临床分期、肿瘤体积、淋巴结转移无明显相关（p>0.05）。
AQP-1在子口腔癌中的阳性表达率为87.1%（31/36），阳性物质主要表达在血管内皮细胞胞浆，而且位于肿瘤的中心部位的表达较强，而肿瘤外周血管内皮细胞表达较弱；表达水平与肿瘤体积、临床分期明显相关（r0.741p<0.01和r0.875 p<0.001），与分化程度、淋巴结转移、浸润深度之间无明显相关（p<0.05）。
CD105主要表达在肿瘤组织及其周围组织的血管内皮细胞，标记的血管分为窦状扩张型、芽状和细索状、球状血管丛。而且大多数血管内皮较幼稚，体积较大，呈卵圆形，而且基底膜不连续，在肿瘤中央的某些新生血管甚至只见到几个黄染的内皮细胞，未见基底膜样物质围绕。微血管密度与肿瘤体积存在明显相关（r0.856p<0.05），与临床分期、分化程度、淋巴结转移之间无明显相关（p>0.05）
3 讨论
口腔鳞癌是颌面部常见肿瘤，口腔鳞癌倾向于早期浸润和淋巴结转移，不仅影响临床分期，而且直接影响手术效果，甚至导致丧失手术机会，因此有关局部浸润机制研究意义重大。而肿瘤血管新生增加了肿瘤获得营养和淋巴结转移的机会，因此研究肿瘤血管新生意义深远，而肿瘤组织持续缺氧是诱导新生血管生成的关键因子[1、2、3、4、5]。而上述机制的关键环节是缺氧诱导因子的激活。
缺氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor,HIF-1）是在缺氧条件下广泛存在于哺乳动物和人体内的一种转录因子，其活性主要依靠HIF-1α实现，缺氧条件下HIF-1α进入细胞核，结合低氧效应元件，上调大量编码血管生成的蛋白基因表达，因此检测HIF-1α可动态观察组织缺氧状态；同时HIF-1α可调节多种靶基因如血管内皮生长因子，红细胞生成素等的表达，其活性在维持肿瘤细胞的能量代谢、新生血管形成以及促进肿瘤增殖和转移中起重要作用，称为缺氧基因表达的总开关[6、7]。我们的实验结果显示HIF-1α在口腔鳞癌中的阳性表达率分别为50%（18/36），与国外研究中食管癌阳性表达率类似，而明显低于喉癌的阳性表达率，说明不同肿瘤组织耐受缺氧能力具有特异性，而且缺氧调控主要机制存在差异；HIF-1α表达水平与肿瘤分化之间存在相关，Kilic U 等在研究子宫内膜癌时发现，浸润至外肌层的肿瘤细胞高表达HIF-1α，相反浸润内肌层的肿瘤组织表达较弱[9、10]。说明随肿瘤去分化，肿瘤代谢加剧，需氧量增加；肿瘤浸润深度增加，肿瘤内部流体静力学发生变化，血管内压力增加，加剧缺氧，因此导致HIF-1α的高表达，启动以VEGF为主的血管形成因子，在促进肿瘤血管形成中起重要作用。
水跨膜转运是细胞生存和生长的必要条件，水通道蛋白（aquaporinAQPs）是一类高效转运水分子的特异孔道，与水分子的快速跨膜转运密切相关， AQP-1正常在血管内皮细胞浆或膜表达，目前主要对此的研究集中在脑损伤导致的细胞水肿和再灌注等方面。新近研究显示在肿瘤细胞系或细胞株中高表达，提示AQP-1表达与肿瘤高血管渗透性有潜在关系，Ong C 等研究显示AQP-1高表达与骨髓瘤的相关血管生成成正比，与疾病的进展密切相关，推测AQP-1参与肿瘤血管生成[8]。可能通过与VEGF协同作用，增加肿瘤血管的通透性，便利内皮细胞增殖、迁移，而且高渗透性引起血浆外渗，为基底膜样物质形成提供物质条件，同时流体静力压升高，加重缺氧，也激活缺氧诱导因子，导致血管生成[11、12]。本实验AQP-1阳性表达率为为87.1%（31/36），阳性物质主要表达在血管内皮细胞胞浆，而且位于肿瘤的中心部位的表达较强，而肿瘤外周血管内皮细胞表达较弱；说明缺氧严重的中心部位肿瘤细胞缺氧严重，诱导内皮细胞表达AQP-1升高，暂时缓解缺氧带来的代谢及营养障碍；AQP-1的表达水平与肿瘤体积、临床分期明显相关（p<0.05和p<0.001），说明随肿瘤体积的增加、临床分期的进展，肿瘤缺氧更加严重，需氧增加，诱导肿瘤内皮细胞表达AQP-1，通过局部渗透获得营养，刺激内皮细胞增殖分化迁移，进一步生成新血管。同时进一步加重的缺氧也诱导缺氧诱导因子表达，进一步刺激血管生成。
三种指标表达水平之间两两作直线相关分析显示： AQP-1的表达水平与HIF-1α的表达水平之间存在明显相关（r0.648p<0.05），说明AQP-1表达导致局部缺氧在子口腔癌中发挥重要作用，而诱导血管生成作用不明显。HIF-1α的表达水平与微血管密度之间存在明显相关（ p<0.05），说明HIF-1α是刺激血管生成的关键因子。