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背景:Adeasy腺病毒系统是由T.C.He等改良的基于E1和E3区缺失的重组腺病毒系统。相比传统的在真核细胞中收集和测试重组后的病毒颗粒的方法,其采用了在细菌中通过质粒同源重组的方法获得病毒颗粒,从而简化了腺病毒的构建和测试流程,而且,它能够通过整合入病毒基因组的标记基因GFP实现对转染细胞的荧光追踪,从而在近年来被广泛用作基因转染的载体。目的:用Adeasy系统构建荧光蛋白基因标记的腺病毒载体Ad-hIGF-1,并检测其在靶细胞骨髓间充质干细胞中的表达。设计:重复测量实验。单位:重庆医科大学儿科研究所。方法:实验于2004-11/2005-03在重庆医科大学儿科研究所完成。①重组腺病毒载体的构建:从pcDNA3.1-hIGF-1中扩增出截短的目的基因hIGF-1,按Ad-easy腺病毒系统同源重组的标准步骤获得重组阳性质粒pAd-hIGF-1和重组空白质粒pAd-0,电穿孔转化感受态XL-1细菌,扩增后获得重组腺病毒质粒,去内毒素质粒大抽试剂盒大量抽提质粒备转化HEK293细胞;②腺病毒包装及扩增:PacⅠ酶切线性化pAd-hIGF-1和pAd-0,纯化后转染HEK293细胞,观察GFP的表达,待细胞90%以上漂浮后,冻融法裂解细胞收集第一轮病毒上清即为Ad-hIGF-1(重组目的腺病毒)和Ad-0(重组空白腺病毒),将收集病毒上清重复多次感染293细胞(乒乓交互感染)以提高病毒滴度。③骨髓间充质干细胞的培养及转染!采用通用的标准密度梯度离心法分离纯化兔MSCs于37℃、5%CO2孵箱培养,隔天换液,10d细胞融合达70%~80%,贴壁紧密,细胞形态均一,呈典型的涡漩状排列,传代至第3代按病毒感染复数分组转染。主要观察指标:①腺病毒载体的构建及鉴定。②目的基因hIGF-1在HEK293的表达及病毒滴度。③目的基因在骨髓间充质干细胞中的表达。结果:①重组腺病毒的鉴定:从质粒pcDNA3.1-hIGF-1中顺利扩增出约400bp大小的清晰条带,与预期相符;pMD18-hIGF-1测序结果经Blast2.0比对与公布序列一致性99.9%(281位碱基同义突变,未影响氨基酸翻译:ggt/ggc-Gly);pAdtrack-CMV空载体和pAdtrack-hIGF-1分别双酶切(KpnⅠ和HindⅢ)鉴定正确。质粒pAdEasey-1和Ad-hIGF-1用PacI酶切鉴定鉴定正确。证实病毒质粒同源重组成功。②荧光表达及滴度测定:重组质粒pAd-hIGF-1经PacI线性化后转化HEK293E细胞,48h后在荧光显微镜下即可见GFP的表达,72h表达最强。约5~7d后细胞出现病毒感染的特征性CPE,由此计算出腺病毒滴度为3.0×109pfu/mL。③靶细胞的感染及表达效率:病毒转染骨髓间充质干细胞24h后观察到绿色荧光的表达,72h左右荧光达到最强。免疫细胞化学SP法DAB染色显示在感染的骨髓间充质干细胞胞浆中有棕黄色阳性颗粒出现。SDSPAGE电泳在7.8KD附近出现明显条带,与实际人胰岛素样生长因子-1分子量7.6kD相符,证实转染含目的基因的重组腺病毒后的骨髓间充质干细胞中有较高量的人胰岛素样生长因子-1的表达。结论:本实验用Adeasy系统和扩增的截短型外源性基因hIGF-1构建了具有较强感染能力的腺病毒载体pAd-hIGF-1,免疫细胞化学和WesternBlot等方法检测证实了目的基因在靶细胞骨髓间充质干细胞得到了理想表达。