论文部分内容阅读
摘要[目的]对一株石油烃降解菌TY22的烷烃羟化酶基因alkB克隆测序，并对其外源表达和功能进行研究。[方法]PCR扩增获得alkB基因部分序列，再根据该序列通过染色体步移技术，最终获得完整CDS序列。将alkB基因与pET21b（+）载体构建重组质粒，并转入E.coli BL21（DE3）进行表达。再将alkB基因克隆至pCom8载体中，分别转入E.coli GEc137（pGEc47△B）和Pseudomonas fluorescens KOB2Δ1进行基因功能的互补试验。[结果]染色体步移获得了1 236 bp的烷烃羟化酶基因完整CDS序列（GenBank Accession： KU867870）。诱导表达发现，重组菌在0.1 mmol/L IPTG、30 ℃条件下诱导培养6 h的表达效果最佳，得到与预期相符的46 kDa蛋白。基因功能互补试验发现，重组菌能在以C12～C16为唯一碳源的培养基中生长。[结论]TY22菌株的烷烃羟化酶基因完整CDS序列全长1 236 bp，能氧化C12～C16的中长链烷烃，并能在大肠杆菌中有效表达。
关键词石油烃降解菌；烷烃羟化酶；表达；功能
中图分类号S188文献标识码
A文章编号0517-6611（2017）36-0131-04
Abstract[Objective] To clone and sequence the alkane hydroxylase gene alkB of a petroleum hydrocarbon degrading bacteria TY22，then to clone alkB into express vector for expressing and identifying its function.[Method] First，use PCR amplification to get partial sequence of 1236 bp alkB gene，then obtain the complete CDS sequence by chromosome walking techniques.Second，clone alkB gene into pET21b（+） vector，and transform the recombinant plasmid into E.coli BL21（DE3） for expressing.Third，clone alkB gene into pCom8 vector，and transform the recombinant plasmid into E.coli GEc137（pGEc47△B） and Pseudomonas fluorescens KOB2Δ1 respectively for gene function complementation test.[Result]We got the complete CDS sequence of 1 236 bp alkane hydroxylase gene through chromosome walking techniques （GenBank Accession：KU867870）.The expression strain had the most expression with 0.1 mmol/L IPTG，30 ℃ culture for 6 hours，relative molecular mass 46 kDa was also in line with expectation.Gene function complementation test showed that the recombinant strains can grow in the medium with nalkanes C12～C16 as sole carbon source.[Conclusion] Alkane hydroxylase gene alkB complete CDS sequence length of strain TY22 was 1 236 bp.It can oxidize nalkanes with chain length C12～C16，and efficient expression in E.coli BL21（DE3）.
Key wordsPetroleum hydrocarbon degrading bacteria；Alkane hydroxylase；Expression；Function
石油是目前全世界最为重要的能源物质，但在石油开发过程中经常会产生事故性泄露，在石油制品的生产和使用过程中，也往往会造成大量石油污染物进入土壤、河流和大气而产生严重的环境污染[1～4]。据估计，全球每年有1×109 t石油污染物泄漏或排放至周围环境中，对生态环境造成了极大的破坏[5-6]。随着污染情况日益加剧，高效且不产生二次污染的石油烃微生物修复技术现已成为该领域研究的热点。
烷烃具有高度的还原性，微生物对其进行降解时，通常是由烷烃羟化酶（AlkB，Alkane hydroxylase）启动整个反应。在烷烃羟化酶的催化下，将氧插入烷烃分子中使其变为醇或酮，然后逐步降解为不同类型的脂肪酸，最后通过不同途径将其分解为CO2和H2O[7-9]。所以，烷烃羟化酶作为启动整个降解过程的关键酶，也成为了研究的焦点。
笔者以从南充炼油厂周围被石油污染的土壤中筛选出的一株高效石油烃降解菌TY22为研究对象。经鉴定，该菌归属于拜氏不动杆菌（Acinetobacter beijerinckii），革兰氏染色呈陰性，其最适生长温度和pH分别为30 ℃、7.0，能以链长为12～32的正构烷烃为唯一碳源和能源生长[10-11]。由于该菌是一株能降解中长链烷烃的不动杆菌新种，且其对正构烷烃的降解范围较宽，所以对其解烃基因的克隆和鉴定有着重要的意义。该研究以期为后续石油烃污染修复工程提供优良的遗传资源，同时对其应用到石油烃污染的生物修复具有重要的实践意义。 1材料与方法
1.1菌株与载体
石油烃降解菌TY22，由西华师范大学微生物学实验室保存；宿主菌E.coli GEc137（pGEc47△B）（抗四环素Tetr）和宿主菌Pseudomonas fluorescens KOB2△1，由瑞士Zürich大学van Beilen教授赠送，西华师范大学微生物学实验室保存；E.coli DH5α和E.coli BL21（DE3）感受态细胞，购自北京TIANGEN有限公司；pCom8质粒（抗庆大霉素Gmr），由瑞士Zürich大学van Beilen教授赠送，西华师范大学微生物学实验室保存；pET21b（+） express vector（抗氨苄青霉素Ampr），西华师范大学微生物学实验室保存；pMD19-T Vector（抗氨苄青霉素Ampr），购自大连TaKaRa有限公司。
1.2主要试剂与酶
PrimeSTAR Max Premix（2×）、QuickCut Nde I、QuickCut Xho I、QuickCut Sal I、T4 DNA Ligase等购自大连TaKaRa有限公司；2×Taq PCR MasterMix、DNA Marker、双色预染蛋白质Marker、细菌基因组DNA离心柱型提取试剂盒、通用型DNA离心柱型纯化回收试剂盒、质粒离心柱型小提试剂盒等购自北京TIANGEN有限公司。
1.3引物该研究所用引物见表1，引物均合成于上海英潍捷基有限公司，PAGE纯化。
1.4 烷烃羟化酶基因的克隆、测序
以TY22菌株基因组DNA为模板，利用引物alkBwf/alkBwr和2×Taq PCR MasterMix进行PCR扩增，反应条件为95 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃后延伸10 min。将获得的PCR产物纯化回收后，克隆到pMD19-T Vector中，并转入E.coli DH5α，筛选阳性克隆后测序。最后将TY22菌株送往上海生物工程有限公司，根据上一步获得的烷烃羟化酶基因alkB部分序列，利用染色体步移技术得到alkB基因的完整CDS序列。
1.5烷烃羟化酶基因序列及氨基酸序列分析
将TY22菌株的烷烃羟化酶基因alkB完整CDS序列在NCBI网站进行Nucleotide BLAST比对；将其对应蛋白质氨基酸序列在NCBI网站进行Protein BLAST比对；利用EXPASY网站ProtParam工具，在线分析氨基酸数目、蛋白质相对分子质量、理论等电点pI等；将氨基酸序列提交NPS@ ：SOPMA secondary structure prediction网站预测蛋白二级结构；利用SWISS-MODEL网站，将氨基酸序列提交后进行三维同源建模分析，在线预测蛋白的三级结构。
1.6烷烃羟化酶基因在大肠杆菌中诱导表达
1.6.1目的基因的PCR扩增。以TY22菌株基因组DNA为模板，利用上游引物P1/下游引物P3和PrimeSTAR Max Premix（2×）进行PCR扩增，获取带有Nde I和Xho I 这2个酶切位点及其保护碱基的alkB基因的完整CDS序列。反应条件为98 ℃预变性3 min；98 ℃变性10 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸2 min，共35个循环；72 ℃后延伸10 min。PCR结束后将产物纯化回收。
1.6.2构建pET21b（+）-alkB重组质粒。将上一步获得的PCR纯化回收产物和pET21b（+） express vector分别进行Nde I、Xho I双酶切，各自回收酶切产物后利用T4 DNA Ligase 16 ℃连接过夜，最后转入E.coli BL21（DE3）并篩选阳性重组菌。
1.6.3重组菌诱导表达电泳。将过夜培养的重组菌按1%接种量接入含相应抗生素的LB培养基中，培养至OD600≈0.6。然后按：①终浓度分别为0.1、0.2、0.5、1.0 mmol/L的IPTG；②25、30、37 ℃的培养温度；③2、4、6 h的培养时间这3种条件分别诱导培养重组菌，然后用8%分离胶SDS-PAGE电泳检测表达结果，探究IPTG浓度、温度和时间对其诱导表达的影响。
1.7烷烃羟化酶基因缺失与互补功能验证
1.7.1目的基因的PCR扩增。以TY22菌株基因组DNA为模板，利用上游引物P1/下游引物P2和PrimeSTAR Max Premix（2×）进行PCR扩增，获取带有Nde I和Sal I 这2个酶切位点及其保护碱基的alkB基因的完整CDS序列。反应条件为98 ℃预变性3 min；98 ℃变性10 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸2 min，共35个循环；72 ℃后延伸10 min。PCR结束后将产物纯化回收。
1.7.2构建pCom8alkB重组质粒。将上一步获得的PCR纯化回收产物和pCom8质粒分别进行Nde I、Sal I双酶切，各自回收酶切产物后利用T4 DNA Ligase 16 ℃连接过夜，最后转入E.coli GEc137（pGEc47△B）和Pseudomonas fluorescens KOB2△1中筛选阳性重组菌。
1.7.3重组菌的功能互补试验。将过夜培养的E.coli GEc137（pGEc47△B）阳性重组菌，按1%接种量分别接入含有1% C8、C10、C12正构烷烃为唯一碳源的E2无机盐培养基中37 ℃、180 r/min培养，观察其生长情况；将过夜培养的Pseudomonas fluorescens KOB2△1阳性重组菌，按1%接种量分别接入含有1% C12、C14、C16正构烷烃为唯一碳源的E2无机盐培养基中37 ℃、180 r/min培养，观察其生长情况。 2结果与分析
2.1烷烃羟化酶基因的克隆及测序
根据参考文献可知，引物alkBwf/alkBwr的目的产物约为550 bp。以TY22菌株基因组DNA为模板，PCR扩增结果见图1。由图1可知，目的片段大小与预期相符，对其回收后TA克隆测序。
测序比对后发现该序列与alkane hydroxylase（烷烃羟化酶AlkB）基因序列存在很高的同源性，由此推测其为TY22菌株烷烃羟化酶基因alkB的部分序列。将菌株送至上海生物工程有限公司，根据此序列利用染色体步移技术得到全长1 236 bp的alkB基因完整CDS序列，GenBank登录号为KU867870，其对应氨基酸序列登录号为AMO65651。
2.2烷烃羟化酶基因序列及氨基酸序列分析
2.2.1BLAST比对分析。将所得烷烃羟化酶基因alkB完整CDS序列在NCBI网站进行Nucleotide BLAST比对，结果发现该序列与Acinetobacter beijerinckii的烷烃羟化酶基因序列存在很高的同源性，其中与Acinetobacter sp.M-1（GenBank登录号AB049410.1）的alkB基因的同源性达88%。利用NCBIORF Finder预测ORF并将其对应氨基酸序列在NCBI网站进行Protein BLAST比对，结果发现与多株Acinetobacter beijerinckii的烷烃羟化酶氨基酸序列存在极高的同源性，最高可达99%。由此可以推断，所得序列即为TY22菌株的烷烃羟化酶基因alkB序列。
2.2.2蛋白理化性质分析。利用EXPASY网站ProtParam工具，在线分析氨基酸数目、蛋白质相对分子质量、理论等电点pI等，结果如下：氨基酸数目411，相对分子质量46.7 kDa，
理论等电点pI 9.22，Asp+Glu 41，Arg+Lys 50，分子式C2137H3297N571O588S11，
不稳定指数43.90，脂溶性指数86.67，总平均亲水性GRAVY-0.331。
2.2.3蛋白二级结构、三级结构预测。 将氨基酸序列提交NPS@ ：SOPMA secondary structure prediction网站预测蛋白二级结构，结果发现该蛋白二级结构主要由α螺旋（h）、β转角（t）、无规则卷曲（c）和延伸链（e）4种组成。其中α螺旋占37.47%，包含154个氨基酸；β转角占10.71%，包含44个氨基酸；无规则卷曲占35.28%，包含145个氨基酸；延伸链占16.55%，包含68个氨基酸。利用SWISS-MODEL网站进行三维同源建模分析，预测蛋白三级结构，结果见图2。
由二、三级结构预测结果可知，该蛋白有5～6个α螺旋，推测其结构与P.putida Gpo1菌株的烷烃羟化酶AlkB结构类似，几个α螺旋构成一个袋状结构域。当烷烃进入后，其中1个α螺旋的疏水性侧链伸入袋中形成底物结合中心，烷烃末端的甲基靠近“袋口”形成催化中心，由此开始对烷烃的末端进行氧化。
2.3烷烃羟化酶基因在大肠杆菌中诱导表达
2.3.1PCR扩增与构建重组质粒。以TY22菌株基因组DNA为模板，利用引物P1/P3扩增得到一条大小相符的片段，纯化回收后与pET21b（+）载体分别进行Nde I、Xho I双酶切，并利用T4 DNA Ligase 16 ℃连接过夜，最后转入E.coli BL21（DE3）筛选阳性重组菌，结果见图3。
2.3.2重组菌诱导表达电泳。将重组菌在LB培养基中37 ℃、180 r/min培养至OD600≈0.6时，分别加入IPTG至终浓度为0.1、0.2、0.5、1.0 mmol/L，30 ℃、180 r/min诱导6 h，然后用8%分离胶SDS-PAGE电泳检测，结果见图4。由图4可知，重组菌在0.1 mmol/L IPTG、30 ℃条件下诱导培养6 h的表达效果最佳，所得的46 kDa蛋白与预期理論值相符。
2.4烷烃羟化酶基因缺失与互补功能验证
2.4.1PCR扩增与构建重组质粒。以TY22菌株基因组DNA为模板，利用引物P1/P2扩增得到1条大小相符的片段，纯化回收后与pCom8载体分别进行Nde I、Sal I双酶切，并利用T4 DNA Ligase 16 ℃连接过夜，最后转入E.coli GEc137（pGEc47△B）和Pseudomonas fluorescens KOB2Δ1中筛选阳性重组菌，结果见图5。
2.4.2重组菌的功能互补试验。2001年，瑞士van Beilen教授等构建出了E.coliPseudomonas穿梭表达质粒pCom8，该质粒能在E.coli或Pseudomonas中复制和表达外源基因，并可受烷烃及类似物的诱导，能用于检测烷烃降解途径中重要的酶基因[13]。
E.coli GEc137（pGEc47△B）菌株中含有pGEc47△B质粒，其上带有P.putida GPo1菌株除烷烃羟化酶基因alkB以外的完整烷烃降解基因簇，因此该菌不能以C6～C12的正构烷烃作为唯一碳源生长。如果将合适的alkB基因构建到pCom8载体中组成重组质粒，并转入E.coli GEc137（pGEc47△B）中表达，便能使烷烃羟化酶基因的功能互补，从而其重组菌就可以C6～C12的正构烷烃作为唯一碳源生长。
P.fluorescens KOB2Δ1是P.fluorescens CHA0的alkB1基因缺失菌株，因此它不能以C12～C16的正构烷烃作为唯一碳源生长，如果将能氧化C12～C16烷烃的烷烃羟化酶基因构建到pCom8 载体中组成重组质粒，并转入P.fluorescens KOB2Δ1中表达，便能使alkB基因的功能互补，其重组菌就可以C12～C16的正构烷烃作为唯一碳源生长。 将TY22菌株的烷烃羟化酶基因alkB构建到pCom8质粒中，得到重组质粒pCom8-alkB，将其分别转入上述2株alkB基因缺失宿主菌中，并置于含相应正构烷烃为唯一碳源的E2无机盐培养基中培养，观察其生長情况，结果见表2。由表2可知，TY22菌株的烷烃羟化酶能氧化C12～C16的中长链烷烃。
3结论
（1）以TY22基因组DNA为模板，利用引物alkBwf/alkBwr PCR扩增得到TY22菌株的烷烃羟化酶基因的部分序列。再根据所得序列通过染色体步移技术，最终获得TY22菌株烷烃羟化酶基因alkB的完整CDS序列，该序列全长1 236 bp，GenBank登录号为KU867870。经分析，该基因编码一段411 aa的蛋白质，其相对分子量为46.7 kDa，等电点9.22。预测其二级结构，α螺旋占37.47%，β转角占10.71%，无规则卷曲占35.28%，延伸链占16.55%。
（2）选择pET21b（+）作为表达载体，将其与TY22菌株的烷烃羟化酶基因alkB构建得到pET21b（+）-alkB重组质粒，再将其转入E.coli BL21（DE3）中进行表达。结果发现，重组菌在0.1 mmol/L IPTG、30 ℃条件下诱导培养6 h的表达效果最佳，所得的46 kDa蛋白也与预期理论值相符。
（3）将TY22菌株烷烃羟化酶基因alkB与pCom8质粒构建得到pCom8-alkB重组质粒，再将重组质粒分别转入E.coli GEc137（pGEc47△B）和Pseudomonas fluorescens KOB2Δ1中进行基因的功能互补试验，结果发现，TY22菌株的烷烃羟化酶能氧化C12～C16的中长链烷烃。
参考文献
[1]
阚兴艳，于君宝，王雪宏，等.石油污染湿地土壤生物修复研究进展[J].湿地科学，2012，10（2）：250-256.
[2] LIU C W，LIANG M S，CHEN Y C，et al.Biodegradation of nalkanes at high concentration and correlation to the accumulation of H+ ions in Rhodococcus erythropolis NTU1[J].Biochemical engineering journal，2012，63（8）：124-128.
[3] 王小雨，冯江，王静.莫莫格湿地油田开采区土壤石油烃污染及对土壤性质的影响[J].环境科学，2009，30（8）：2394-2401.
[4] 朱杰，阮志勇，董卫卫，等.一株高效烷烃降解菌 Acinetobacter sp.LAM1007 的分离鉴定及降解特性[J].微生物学通报，2017，44（7）：1535-1546.
[5] 李永霞，郑西来，马艳飞.石油污染物在土壤中的环境行为研究进展[J].安全与环境工程，2011，18（4）：43-47.
[6] WATANABE K，KODAMA Y，SYUTSUBO K，et al.Molecular characterization of bacterial populations in petroleumcontaminated groundwater discharged from underground crude oil storage cavities[J].Applied & environmental microbiology，2000，66（11）：4803-4809.
[7] YONG N，CHI C Q，FANG H，et al.Diverse alkane hydroxylase genes in microorganisms and environments[J].Scientific reports，2014，4（7500）：1-11.
[8] JEON H J，KIM M N.Functional analysis of alkane hydroxylase system derived from Pseudomonas aeruginosa E7 for low molecular weight polyethylene biodegradation[J].International biodeterioration & biodegradation，2015，103：141-146.
[9] 唐赟.嗜热菌NG80-2的烃降解特性及其烷烃单加氧酶分子生物学研究[D].天津：南开大学，2006.
[10] 唐赟，谭洪.一株高效降解中长链烷烃菌株的分离鉴定及其降解特性研究[J].生物过程，2013（3）：9-15.
[11] 敬删，唐赟.一株降解中长链烷烃菌株TWJ22的解烃特性研究[J].西华师范大学学报（自然科学版），2017，38（2）：141-145.
[12] WANG L P，WANG W P，LAI Q L，et al.Gene diversity of CYP153A and alkB alkane hydroxylases in oildegrading bacteria isolated from the Atlantic Ocean[J].Environmental microbiology，2010，12（5）：1230-1242.
[13] SMITS T H M，SEEGER M A，WITHOLT B，et al.New alkaneresponsive expression vectors for Escherichia coli and Pseudomonas[J].Plasmid，2001，46（1）：16-24.
关键词石油烃降解菌；烷烃羟化酶；表达；功能
中图分类号S188文献标识码
A文章编号0517-6611（2017）36-0131-04
Abstract[Objective] To clone and sequence the alkane hydroxylase gene alkB of a petroleum hydrocarbon degrading bacteria TY22，then to clone alkB into express vector for expressing and identifying its function.[Method] First，use PCR amplification to get partial sequence of 1236 bp alkB gene，then obtain the complete CDS sequence by chromosome walking techniques.Second，clone alkB gene into pET21b（+） vector，and transform the recombinant plasmid into E.coli BL21（DE3） for expressing.Third，clone alkB gene into pCom8 vector，and transform the recombinant plasmid into E.coli GEc137（pGEc47△B） and Pseudomonas fluorescens KOB2Δ1 respectively for gene function complementation test.[Result]We got the complete CDS sequence of 1 236 bp alkane hydroxylase gene through chromosome walking techniques （GenBank Accession：KU867870）.The expression strain had the most expression with 0.1 mmol/L IPTG，30 ℃ culture for 6 hours，relative molecular mass 46 kDa was also in line with expectation.Gene function complementation test showed that the recombinant strains can grow in the medium with nalkanes C12～C16 as sole carbon source.[Conclusion] Alkane hydroxylase gene alkB complete CDS sequence length of strain TY22 was 1 236 bp.It can oxidize nalkanes with chain length C12～C16，and efficient expression in E.coli BL21（DE3）.
Key wordsPetroleum hydrocarbon degrading bacteria；Alkane hydroxylase；Expression；Function
石油是目前全世界最为重要的能源物质，但在石油开发过程中经常会产生事故性泄露，在石油制品的生产和使用过程中，也往往会造成大量石油污染物进入土壤、河流和大气而产生严重的环境污染[1～4]。据估计，全球每年有1×109 t石油污染物泄漏或排放至周围环境中，对生态环境造成了极大的破坏[5-6]。随着污染情况日益加剧，高效且不产生二次污染的石油烃微生物修复技术现已成为该领域研究的热点。
烷烃具有高度的还原性，微生物对其进行降解时，通常是由烷烃羟化酶（AlkB，Alkane hydroxylase）启动整个反应。在烷烃羟化酶的催化下，将氧插入烷烃分子中使其变为醇或酮，然后逐步降解为不同类型的脂肪酸，最后通过不同途径将其分解为CO2和H2O[7-9]。所以，烷烃羟化酶作为启动整个降解过程的关键酶，也成为了研究的焦点。
笔者以从南充炼油厂周围被石油污染的土壤中筛选出的一株高效石油烃降解菌TY22为研究对象。经鉴定，该菌归属于拜氏不动杆菌（Acinetobacter beijerinckii），革兰氏染色呈陰性，其最适生长温度和pH分别为30 ℃、7.0，能以链长为12～32的正构烷烃为唯一碳源和能源生长[10-11]。由于该菌是一株能降解中长链烷烃的不动杆菌新种，且其对正构烷烃的降解范围较宽，所以对其解烃基因的克隆和鉴定有着重要的意义。该研究以期为后续石油烃污染修复工程提供优良的遗传资源，同时对其应用到石油烃污染的生物修复具有重要的实践意义。 1材料与方法
1.1菌株与载体
石油烃降解菌TY22，由西华师范大学微生物学实验室保存；宿主菌E.coli GEc137（pGEc47△B）（抗四环素Tetr）和宿主菌Pseudomonas fluorescens KOB2△1，由瑞士Zürich大学van Beilen教授赠送，西华师范大学微生物学实验室保存；E.coli DH5α和E.coli BL21（DE3）感受态细胞，购自北京TIANGEN有限公司；pCom8质粒（抗庆大霉素Gmr），由瑞士Zürich大学van Beilen教授赠送，西华师范大学微生物学实验室保存；pET21b（+） express vector（抗氨苄青霉素Ampr），西华师范大学微生物学实验室保存；pMD19-T Vector（抗氨苄青霉素Ampr），购自大连TaKaRa有限公司。
1.2主要试剂与酶
PrimeSTAR Max Premix（2×）、QuickCut Nde I、QuickCut Xho I、QuickCut Sal I、T4 DNA Ligase等购自大连TaKaRa有限公司；2×Taq PCR MasterMix、DNA Marker、双色预染蛋白质Marker、细菌基因组DNA离心柱型提取试剂盒、通用型DNA离心柱型纯化回收试剂盒、质粒离心柱型小提试剂盒等购自北京TIANGEN有限公司。
1.3引物该研究所用引物见表1，引物均合成于上海英潍捷基有限公司，PAGE纯化。
1.4 烷烃羟化酶基因的克隆、测序
以TY22菌株基因组DNA为模板，利用引物alkBwf/alkBwr和2×Taq PCR MasterMix进行PCR扩增，反应条件为95 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃后延伸10 min。将获得的PCR产物纯化回收后，克隆到pMD19-T Vector中，并转入E.coli DH5α，筛选阳性克隆后测序。最后将TY22菌株送往上海生物工程有限公司，根据上一步获得的烷烃羟化酶基因alkB部分序列，利用染色体步移技术得到alkB基因的完整CDS序列。
1.5烷烃羟化酶基因序列及氨基酸序列分析
将TY22菌株的烷烃羟化酶基因alkB完整CDS序列在NCBI网站进行Nucleotide BLAST比对；将其对应蛋白质氨基酸序列在NCBI网站进行Protein BLAST比对；利用EXPASY网站ProtParam工具，在线分析氨基酸数目、蛋白质相对分子质量、理论等电点pI等；将氨基酸序列提交NPS@ ：SOPMA secondary structure prediction网站预测蛋白二级结构；利用SWISS-MODEL网站，将氨基酸序列提交后进行三维同源建模分析，在线预测蛋白的三级结构。
1.6烷烃羟化酶基因在大肠杆菌中诱导表达
1.6.1目的基因的PCR扩增。以TY22菌株基因组DNA为模板，利用上游引物P1/下游引物P3和PrimeSTAR Max Premix（2×）进行PCR扩增，获取带有Nde I和Xho I 这2个酶切位点及其保护碱基的alkB基因的完整CDS序列。反应条件为98 ℃预变性3 min；98 ℃变性10 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸2 min，共35个循环；72 ℃后延伸10 min。PCR结束后将产物纯化回收。
1.6.2构建pET21b（+）-alkB重组质粒。将上一步获得的PCR纯化回收产物和pET21b（+） express vector分别进行Nde I、Xho I双酶切，各自回收酶切产物后利用T4 DNA Ligase 16 ℃连接过夜，最后转入E.coli BL21（DE3）并篩选阳性重组菌。
1.6.3重组菌诱导表达电泳。将过夜培养的重组菌按1%接种量接入含相应抗生素的LB培养基中，培养至OD600≈0.6。然后按：①终浓度分别为0.1、0.2、0.5、1.0 mmol/L的IPTG；②25、30、37 ℃的培养温度；③2、4、6 h的培养时间这3种条件分别诱导培养重组菌，然后用8%分离胶SDS-PAGE电泳检测表达结果，探究IPTG浓度、温度和时间对其诱导表达的影响。
1.7烷烃羟化酶基因缺失与互补功能验证
1.7.1目的基因的PCR扩增。以TY22菌株基因组DNA为模板，利用上游引物P1/下游引物P2和PrimeSTAR Max Premix（2×）进行PCR扩增，获取带有Nde I和Sal I 这2个酶切位点及其保护碱基的alkB基因的完整CDS序列。反应条件为98 ℃预变性3 min；98 ℃变性10 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸2 min，共35个循环；72 ℃后延伸10 min。PCR结束后将产物纯化回收。
1.7.2构建pCom8alkB重组质粒。将上一步获得的PCR纯化回收产物和pCom8质粒分别进行Nde I、Sal I双酶切，各自回收酶切产物后利用T4 DNA Ligase 16 ℃连接过夜，最后转入E.coli GEc137（pGEc47△B）和Pseudomonas fluorescens KOB2△1中筛选阳性重组菌。
1.7.3重组菌的功能互补试验。将过夜培养的E.coli GEc137（pGEc47△B）阳性重组菌，按1%接种量分别接入含有1% C8、C10、C12正构烷烃为唯一碳源的E2无机盐培养基中37 ℃、180 r/min培养，观察其生长情况；将过夜培养的Pseudomonas fluorescens KOB2△1阳性重组菌，按1%接种量分别接入含有1% C12、C14、C16正构烷烃为唯一碳源的E2无机盐培养基中37 ℃、180 r/min培养，观察其生长情况。 2结果与分析
2.1烷烃羟化酶基因的克隆及测序
根据参考文献可知，引物alkBwf/alkBwr的目的产物约为550 bp。以TY22菌株基因组DNA为模板，PCR扩增结果见图1。由图1可知，目的片段大小与预期相符，对其回收后TA克隆测序。
测序比对后发现该序列与alkane hydroxylase（烷烃羟化酶AlkB）基因序列存在很高的同源性，由此推测其为TY22菌株烷烃羟化酶基因alkB的部分序列。将菌株送至上海生物工程有限公司，根据此序列利用染色体步移技术得到全长1 236 bp的alkB基因完整CDS序列，GenBank登录号为KU867870，其对应氨基酸序列登录号为AMO65651。
2.2烷烃羟化酶基因序列及氨基酸序列分析
2.2.1BLAST比对分析。将所得烷烃羟化酶基因alkB完整CDS序列在NCBI网站进行Nucleotide BLAST比对，结果发现该序列与Acinetobacter beijerinckii的烷烃羟化酶基因序列存在很高的同源性，其中与Acinetobacter sp.M-1（GenBank登录号AB049410.1）的alkB基因的同源性达88%。利用NCBIORF Finder预测ORF并将其对应氨基酸序列在NCBI网站进行Protein BLAST比对，结果发现与多株Acinetobacter beijerinckii的烷烃羟化酶氨基酸序列存在极高的同源性，最高可达99%。由此可以推断，所得序列即为TY22菌株的烷烃羟化酶基因alkB序列。
2.2.2蛋白理化性质分析。利用EXPASY网站ProtParam工具，在线分析氨基酸数目、蛋白质相对分子质量、理论等电点pI等，结果如下：氨基酸数目411，相对分子质量46.7 kDa，
理论等电点pI 9.22，Asp+Glu 41，Arg+Lys 50，分子式C2137H3297N571O588S11，
不稳定指数43.90，脂溶性指数86.67，总平均亲水性GRAVY-0.331。
2.2.3蛋白二级结构、三级结构预测。 将氨基酸序列提交NPS@ ：SOPMA secondary structure prediction网站预测蛋白二级结构，结果发现该蛋白二级结构主要由α螺旋（h）、β转角（t）、无规则卷曲（c）和延伸链（e）4种组成。其中α螺旋占37.47%，包含154个氨基酸；β转角占10.71%，包含44个氨基酸；无规则卷曲占35.28%，包含145个氨基酸；延伸链占16.55%，包含68个氨基酸。利用SWISS-MODEL网站进行三维同源建模分析，预测蛋白三级结构，结果见图2。
由二、三级结构预测结果可知，该蛋白有5～6个α螺旋，推测其结构与P.putida Gpo1菌株的烷烃羟化酶AlkB结构类似，几个α螺旋构成一个袋状结构域。当烷烃进入后，其中1个α螺旋的疏水性侧链伸入袋中形成底物结合中心，烷烃末端的甲基靠近“袋口”形成催化中心，由此开始对烷烃的末端进行氧化。
2.3烷烃羟化酶基因在大肠杆菌中诱导表达
2.3.1PCR扩增与构建重组质粒。以TY22菌株基因组DNA为模板，利用引物P1/P3扩增得到一条大小相符的片段，纯化回收后与pET21b（+）载体分别进行Nde I、Xho I双酶切，并利用T4 DNA Ligase 16 ℃连接过夜，最后转入E.coli BL21（DE3）筛选阳性重组菌，结果见图3。
2.3.2重组菌诱导表达电泳。将重组菌在LB培养基中37 ℃、180 r/min培养至OD600≈0.6时，分别加入IPTG至终浓度为0.1、0.2、0.5、1.0 mmol/L，30 ℃、180 r/min诱导6 h，然后用8%分离胶SDS-PAGE电泳检测，结果见图4。由图4可知，重组菌在0.1 mmol/L IPTG、30 ℃条件下诱导培养6 h的表达效果最佳，所得的46 kDa蛋白与预期理論值相符。
2.4烷烃羟化酶基因缺失与互补功能验证
2.4.1PCR扩增与构建重组质粒。以TY22菌株基因组DNA为模板，利用引物P1/P2扩增得到1条大小相符的片段，纯化回收后与pCom8载体分别进行Nde I、Sal I双酶切，并利用T4 DNA Ligase 16 ℃连接过夜，最后转入E.coli GEc137（pGEc47△B）和Pseudomonas fluorescens KOB2Δ1中筛选阳性重组菌，结果见图5。
2.4.2重组菌的功能互补试验。2001年，瑞士van Beilen教授等构建出了E.coliPseudomonas穿梭表达质粒pCom8，该质粒能在E.coli或Pseudomonas中复制和表达外源基因，并可受烷烃及类似物的诱导，能用于检测烷烃降解途径中重要的酶基因[13]。
E.coli GEc137（pGEc47△B）菌株中含有pGEc47△B质粒，其上带有P.putida GPo1菌株除烷烃羟化酶基因alkB以外的完整烷烃降解基因簇，因此该菌不能以C6～C12的正构烷烃作为唯一碳源生长。如果将合适的alkB基因构建到pCom8载体中组成重组质粒，并转入E.coli GEc137（pGEc47△B）中表达，便能使烷烃羟化酶基因的功能互补，从而其重组菌就可以C6～C12的正构烷烃作为唯一碳源生长。
P.fluorescens KOB2Δ1是P.fluorescens CHA0的alkB1基因缺失菌株，因此它不能以C12～C16的正构烷烃作为唯一碳源生长，如果将能氧化C12～C16烷烃的烷烃羟化酶基因构建到pCom8 载体中组成重组质粒，并转入P.fluorescens KOB2Δ1中表达，便能使alkB基因的功能互补，其重组菌就可以C12～C16的正构烷烃作为唯一碳源生长。 将TY22菌株的烷烃羟化酶基因alkB构建到pCom8质粒中，得到重组质粒pCom8-alkB，将其分别转入上述2株alkB基因缺失宿主菌中，并置于含相应正构烷烃为唯一碳源的E2无机盐培养基中培养，观察其生長情况，结果见表2。由表2可知，TY22菌株的烷烃羟化酶能氧化C12～C16的中长链烷烃。
3结论
（1）以TY22基因组DNA为模板，利用引物alkBwf/alkBwr PCR扩增得到TY22菌株的烷烃羟化酶基因的部分序列。再根据所得序列通过染色体步移技术，最终获得TY22菌株烷烃羟化酶基因alkB的完整CDS序列，该序列全长1 236 bp，GenBank登录号为KU867870。经分析，该基因编码一段411 aa的蛋白质，其相对分子量为46.7 kDa，等电点9.22。预测其二级结构，α螺旋占37.47%，β转角占10.71%，无规则卷曲占35.28%，延伸链占16.55%。
（2）选择pET21b（+）作为表达载体，将其与TY22菌株的烷烃羟化酶基因alkB构建得到pET21b（+）-alkB重组质粒，再将其转入E.coli BL21（DE3）中进行表达。结果发现，重组菌在0.1 mmol/L IPTG、30 ℃条件下诱导培养6 h的表达效果最佳，所得的46 kDa蛋白也与预期理论值相符。
（3）将TY22菌株烷烃羟化酶基因alkB与pCom8质粒构建得到pCom8-alkB重组质粒，再将重组质粒分别转入E.coli GEc137（pGEc47△B）和Pseudomonas fluorescens KOB2Δ1中进行基因的功能互补试验，结果发现，TY22菌株的烷烃羟化酶能氧化C12～C16的中长链烷烃。
参考文献
[1]
阚兴艳，于君宝，王雪宏，等.石油污染湿地土壤生物修复研究进展[J].湿地科学，2012，10（2）：250-256.
[2] LIU C W，LIANG M S，CHEN Y C，et al.Biodegradation of nalkanes at high concentration and correlation to the accumulation of H+ ions in Rhodococcus erythropolis NTU1[J].Biochemical engineering journal，2012，63（8）：124-128.
[3] 王小雨，冯江，王静.莫莫格湿地油田开采区土壤石油烃污染及对土壤性质的影响[J].环境科学，2009，30（8）：2394-2401.
[4] 朱杰，阮志勇，董卫卫，等.一株高效烷烃降解菌 Acinetobacter sp.LAM1007 的分离鉴定及降解特性[J].微生物学通报，2017，44（7）：1535-1546.
[5] 李永霞，郑西来，马艳飞.石油污染物在土壤中的环境行为研究进展[J].安全与环境工程，2011，18（4）：43-47.
[6] WATANABE K，KODAMA Y，SYUTSUBO K，et al.Molecular characterization of bacterial populations in petroleumcontaminated groundwater discharged from underground crude oil storage cavities[J].Applied & environmental microbiology，2000，66（11）：4803-4809.
[7] YONG N，CHI C Q，FANG H，et al.Diverse alkane hydroxylase genes in microorganisms and environments[J].Scientific reports，2014，4（7500）：1-11.
[8] JEON H J，KIM M N.Functional analysis of alkane hydroxylase system derived from Pseudomonas aeruginosa E7 for low molecular weight polyethylene biodegradation[J].International biodeterioration & biodegradation，2015，103：141-146.
[9] 唐赟.嗜热菌NG80-2的烃降解特性及其烷烃单加氧酶分子生物学研究[D].天津：南开大学，2006.
[10] 唐赟，谭洪.一株高效降解中长链烷烃菌株的分离鉴定及其降解特性研究[J].生物过程，2013（3）：9-15.
[11] 敬删，唐赟.一株降解中长链烷烃菌株TWJ22的解烃特性研究[J].西华师范大学学报（自然科学版），2017，38（2）：141-145.
[12] WANG L P，WANG W P，LAI Q L，et al.Gene diversity of CYP153A and alkB alkane hydroxylases in oildegrading bacteria isolated from the Atlantic Ocean[J].Environmental microbiology，2010，12（5）：1230-1242.
[13] SMITS T H M，SEEGER M A，WITHOLT B，et al.New alkaneresponsive expression vectors for Escherichia coli and Pseudomonas[J].Plasmid，2001，46（1）：16-24.