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摘要[目的]对大海马D-loop和Cyt b序列进行遗传变异分析。[方法]基于D-loop和Cyt b部分序列对东山岛（20尾）和泉州市（20尾）养殖场大海马进行遗传变异分析。[结果]获得的D-loop和Cyt b序列分别为707～709 bp和404 bp，且2种序列在2个大海马群体之间极其保守。D-loop和Cyt b序列G+C含量明显低于A+T含量，C含量也低于G含量，Cyt b序列第3位密码子G含量最少。东山岛和泉州市的大海马（各20条）D-loop序列的平均核苷酸差异数分别为0.489和0.958，且分别定义了3种和6种单倍型，东山岛和泉州市的大海马（各20条）Cyt b序列在2个群体之间相似度为100%，只定义了1种单倍型。[结论]研究表明D-loop和Cyt b序列在2个大海马群体中变异较小。
关键词遗传变异；大海马；D-loop；Cyt b
中图分类号S917.4文献标识码A文章编号0517-6611（2017）36-0140-03
Abstract[Objective]To study the genetic variation of Hippocampus kuda base on Dloop and Cyt b sequences.
[Method]In this paper， the genetic variations of H. kuda between Dongshan island（20 individuals） and Quanzhou City（20 individuals） were analyzed base on part of Dloop and Cyt b sequences. [Result]Dloop and Cyt b sequences were 707-709 bp and 404 bp， respectively， and the two sequences were highly conserved between the two populations. G+C content of Dloop and Cyt b sequences were significantly lower than A+ T， however， the C content was lower than G， and G content of Cyt b sequences were the least in the third codon. The average number of nucleotide differences of 20 Dloop sequences of H. kuda from Dongshan island and Quanzhou City were 0.489 and 0.958， and 3 and 6 kinds of haplotypes were defined respectively， meanwhile， the similarity of Cyt b sequences were 100% with a total of 1 haplotype between the two groups. [Conclusion]All the results showed that the variation of Dloop and Cyt b sequences were relatively little in the two population of H. kuda.
Key wordsGenetic variation；Hippocampus kuda；Dloop；Cyt b
大海马（Hippocampus kuda Bleeker）隶属于海龙科（Syngnathidae），是一种小型海洋脊椎动物，因其头部像马头而且与身体形成一个角得名，以挠足类、蔓足类、虾类等小型无脊椎动物为食，主要分布于温带、热带及亚热带沿岸浅水海域[1-2]。海马具有抗血栓、抗衰老等多种药用功能[3-4]，是一种经济价值较高的名贵海产中药材[5]。南海以其独特的地理条件和水温水质而成为我国海马的主要捕捞海域[1]，但野生海马数量有限，而且一般是兼捕获得。我国海马养殖产业发展较慢，养殖技术需要改善和创新，而且鱼类养殖过程中容易出现互相混杂[6]和近交衰退[7]等现象，因此，利用可靠的分子标记对大海马养殖群体进行种质评价有重要意义。
分子标记技术可以检测DNA碱基替换、插入和缺失，获得丰富的遗传变异信息，进而分析其遗传變异和多态性[8-10]。线粒体控制区D-loop序列位于线粒体的非编码区，具有较高的突变率，受自然选择压力极小，能积累的变异较多[11-14]，另外，Cyt b为线粒体功能区，且序列变异率相对较高，种间差异较大[15-18]，因此，D-loop和Cyt b序列被广泛应用于群体遗传多样性、种质鉴定和遗传进化分析，其中涉及的物种包括哺乳类、两栖类、鸟类、鱼类以及无脊椎动物等[19-25]。目前，关于海马的研究主要集中在个体生长、繁殖、遗传进化及保护生物学等方面[26-30]，为了保护海马资源，国内外研究者在分子遗传学方面做了许多研究，例如，Teske等[31]利用D-loop序列对南非海马（Hippocampus capensis）进行了遗传分析；Lourie[32]利用Cyt b序列对三斑海马（Hippocampus trimaculatus）进行了遗传进化分析；李玉龙等[33]也利用D-loop序列对日本海马（Hippocampus japonicus）进行了遗传多样性研究。该研究扩增了大海马D-loop和Cyt b部分序列，对其进行了遗传变异分析，为寻找合适的分子标记研究大海马遗传多样性提供参考，同时也为大海马选育提供科学依据。 1材料与方法
1.1材料
供试大海马于2016年12月采集于福建省漳州市东山岛海马养殖场（20尾）和泉州市海马养殖场（20尾），2个群体的大海马体重和体长比较接近（表1），采集后于无水乙醇中-20 ℃保存。
1.2基因组DNA提取
取大海马成体尾部组织约0.1 g，利用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN）提取海马基因组，通过1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，于4 ℃保存备用。
1.3引物设计及PCR扩增
从NCBI数据库中下载大海马线粒体D-loop序列，进而设计D-loop序列扩增引物F：AAGGAGAATCGAACTCCCACC/R：GGTTACCTGATAATCACGGGG。PCR反应体系：10 × Easy Taq Buffer 2.5 μL，dNTP Mixture 2 μL，DNA模板1 μL，F/R引物各1 μL，5 U/μL Taq DNA polymorase 0.2 μL，用双蒸水补足至25 μL。扩增程序：95 ℃预变性4 min；95 ℃变性30 s，59 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，40个循环；最后72 ℃延伸5 min。此外，参考高天翔等[21]研究扩增Cyt b序列，PCR扩增产物送至广州金唯智公司完成测序。
1.4数据处理
使用MEGA 5.1软件对测序结果进行拼接、校正后，分析2个群体各自的碱基组成；使用DNASP软件计算2代群体的多态性位点，变异位点（variable sites），单倍型（haplotypes，h），单倍型多样性（haplotype diversity，Hd），核苷酸多样性（nucleotide diversity，Nd），平均核苷酸差异数（average number nucleotide differences，k）。
2结果与分析
2.1序列组成
所得D-loop（MF973238～MF973277）和Cyt b（MG018259～MG018298）序列各40条，经校正后长度分别为707～709 bp和404 bp，与NCBI数据库比对一致性均>98%，确认为大海马序列。东山岛和泉州市大海马（各20条）
Cyt b序列T、C、A、G含量一致，分别为30.4%、14.6%、30.4%、24.5%，2个群体Cyt b序列的第3位密码子G含量最少，第2位密码子G含量次之（表2）。20条东山岛大海马D-loop序列T、C、A、G含量分别为33.2%、13.9%、32.0%、20.9%，20条泉州市大海马D-loop序列T、C、A、G含量分别为33.3%、13.9%、31.9%、20.9%。D-loop和Cyt b序列中G+C含量明显低于A+T含量，C含量均低于G含量。
2.2遗传变异
由表3可知，20条东山岛大海马D-loop序列存在变异位点4个，共定义了3种单倍型，其中有18个个体属于同种单倍型，单倍型多样性为0.195±0.115，核苷酸多样性为0.000 69，核苷酸差异数为0.489，20条泉州市大海马D-loop序列变异位点7个，6种单倍型，有13个个体属于同种单倍型，单倍型多样性为0.579±0.124，核苷酸多样性为0.001 36，核苷酸差异数为0.958；东山岛和泉州市的Cyt b序列相似度为100%，单倍型只有1个，序列变异位点、单倍型多样性、核苷酸多样性、核苷酸差异数均为0。2种序列分析结果显示2个养殖场的大海马群体属于低单倍型（h<0.5）且低核苷酸多样性（Nd<0.5%）的群体，与D-loop序列分析结果相比，基于Cyt b序列分析东山岛和泉州市2个养殖场的大海马群体遗传变异水平更低。
3结论与讨论
该试验大海马D-loop和Cyt b序列存在明显的碱基偏倚性，与其他鱼类的研究结果相似，如贺亮等[19]研究发现2 种虾虎鱼A+T含量均高于 C+G 含量，邓朝阳[34]研究中鲫鱼Cyt b 和 D-loop 序列A+T含量也高于 G+C含量，这种偏倚性是大多数脊椎动物线粒体基因的共同特征，有研究者认为这种偏倚性是由于序列中的碱基置换具有倾向性[35]，编码基因的变异是由于密码子的简并性变异积累而成[36]。该试验大海马D-loop和Cyt b序列十分保守，2个群体之间序列差异很小，变异位点数均为1%以下，与其他物种研究结果存在很大差异[12，16，18]，同样，Lourie等[32，37]也发现华莱士线以西的三斑海马（Hippocampus trimaculatus）和亚洲东南部的大海马Cyt b序列变异较小的现象；Sanders等[38]也发现美国加利福尼亚海马D-loop和Cyt b序列进化速率都很低，表明海马D-loop和Cyt b序列与其他物种进化速率不一致。东山岛和泉州市2个大海马群体的D-loop和Cyt b序列保守性与大海马繁殖方式和生活习性有关，大海马的繁殖方式非常独特，因为雌海马把卵产在雄海马的育儿袋内，雄海马孵化出幼海马后没有精力照料和保护幼海马，造成小海马的成活率极低，这种低存活率会造成遗传漂变，进而影响线粒体进化速率。
群体遗传多样性的分子标记很多，但不同的分子标记适用性存在差异。变异位点、核苷酸多样性等参数在一定程度上可以判断一个群体的遗传多样性水平[39]。该研究结合Cyt b和D-loop序列对东山岛和泉州市的大海马群体进行分析发现单倍型多样性（Hd<0.5）和核苷酸多样性（Nd<0.5%）很低，变异位点数为0～7，说明大海马群体遗传变异较小。同样，在很多其他海马的研究中也发现类似的情况，例如太平洋海马（Hippocampus ingens）[30]、日本海馬（Hippocampus japonicus）[33]、短吻海马（Hippocampus guttulatus）[40]、南非海马（Hippocampus capensis）[31] 等其他几种海马的遗传多样性也处于低水平，但与该试验结果相比其遗传变异较大，而且其高单倍型多样性且低核苷酸多样性的遗传多样性模式与该试验模式不一样。一般认为，低单倍型多样性且低核苷酸多样性的遗传多样性模式是因为群体在近期养殖过程中产生了种群瓶颈效应或者奠基者效应。该试验大海马属于养殖品种，遗传变异较小可能是受到人工养殖影响[41-42]，要确定遗传变异较小是否与养殖有关，必须与养殖前的群体进行比较，此外，不同的物种类别遗传多样性必然有差异，海马的特殊繁殖方式在遗传变异中有限制进化速率的作用。结合其他人研究结果推测，海马线粒体序列比较保守，D-loop和Cyt b序列检测到的变异位点有限，检测其遗传多样性需要结合SNP和微卫星等技术。遗传物质变异积累的遗传多样性不仅决定物种的环境适应能力，而且对群体的种质变化有决定性意义，遗传变异越大，一个群体遗传多样性越丰富，该群体的生存能力就越强，群体数量也越多，反之群体数量越少。因此，基于该试验获取的D-loop和Cyt b序列分析显示福建东山岛和泉州市2地的大海马群体遗传变异较小，在一定程度上也反映了该地区海马种质稀缺的现象。在养殖过程中，应在优质的基础群体条件下，尽可能加大养殖基础群体和避免近亲繁殖才能维持较高的群体遗传多样性。 参考文献
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关键词遗传变异；大海马；D-loop；Cyt b
中图分类号S917.4文献标识码A文章编号0517-6611（2017）36-0140-03
Abstract[Objective]To study the genetic variation of Hippocampus kuda base on Dloop and Cyt b sequences.
[Method]In this paper， the genetic variations of H. kuda between Dongshan island（20 individuals） and Quanzhou City（20 individuals） were analyzed base on part of Dloop and Cyt b sequences. [Result]Dloop and Cyt b sequences were 707-709 bp and 404 bp， respectively， and the two sequences were highly conserved between the two populations. G+C content of Dloop and Cyt b sequences were significantly lower than A+ T， however， the C content was lower than G， and G content of Cyt b sequences were the least in the third codon. The average number of nucleotide differences of 20 Dloop sequences of H. kuda from Dongshan island and Quanzhou City were 0.489 and 0.958， and 3 and 6 kinds of haplotypes were defined respectively， meanwhile， the similarity of Cyt b sequences were 100% with a total of 1 haplotype between the two groups. [Conclusion]All the results showed that the variation of Dloop and Cyt b sequences were relatively little in the two population of H. kuda.
Key wordsGenetic variation；Hippocampus kuda；Dloop；Cyt b
大海马（Hippocampus kuda Bleeker）隶属于海龙科（Syngnathidae），是一种小型海洋脊椎动物，因其头部像马头而且与身体形成一个角得名，以挠足类、蔓足类、虾类等小型无脊椎动物为食，主要分布于温带、热带及亚热带沿岸浅水海域[1-2]。海马具有抗血栓、抗衰老等多种药用功能[3-4]，是一种经济价值较高的名贵海产中药材[5]。南海以其独特的地理条件和水温水质而成为我国海马的主要捕捞海域[1]，但野生海马数量有限，而且一般是兼捕获得。我国海马养殖产业发展较慢，养殖技术需要改善和创新，而且鱼类养殖过程中容易出现互相混杂[6]和近交衰退[7]等现象，因此，利用可靠的分子标记对大海马养殖群体进行种质评价有重要意义。
分子标记技术可以检测DNA碱基替换、插入和缺失，获得丰富的遗传变异信息，进而分析其遗传變异和多态性[8-10]。线粒体控制区D-loop序列位于线粒体的非编码区，具有较高的突变率，受自然选择压力极小，能积累的变异较多[11-14]，另外，Cyt b为线粒体功能区，且序列变异率相对较高，种间差异较大[15-18]，因此，D-loop和Cyt b序列被广泛应用于群体遗传多样性、种质鉴定和遗传进化分析，其中涉及的物种包括哺乳类、两栖类、鸟类、鱼类以及无脊椎动物等[19-25]。目前，关于海马的研究主要集中在个体生长、繁殖、遗传进化及保护生物学等方面[26-30]，为了保护海马资源，国内外研究者在分子遗传学方面做了许多研究，例如，Teske等[31]利用D-loop序列对南非海马（Hippocampus capensis）进行了遗传分析；Lourie[32]利用Cyt b序列对三斑海马（Hippocampus trimaculatus）进行了遗传进化分析；李玉龙等[33]也利用D-loop序列对日本海马（Hippocampus japonicus）进行了遗传多样性研究。该研究扩增了大海马D-loop和Cyt b部分序列，对其进行了遗传变异分析，为寻找合适的分子标记研究大海马遗传多样性提供参考，同时也为大海马选育提供科学依据。 1材料与方法
1.1材料
供试大海马于2016年12月采集于福建省漳州市东山岛海马养殖场（20尾）和泉州市海马养殖场（20尾），2个群体的大海马体重和体长比较接近（表1），采集后于无水乙醇中-20 ℃保存。
1.2基因组DNA提取
取大海马成体尾部组织约0.1 g，利用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN）提取海马基因组，通过1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，于4 ℃保存备用。
1.3引物设计及PCR扩增
从NCBI数据库中下载大海马线粒体D-loop序列，进而设计D-loop序列扩增引物F：AAGGAGAATCGAACTCCCACC/R：GGTTACCTGATAATCACGGGG。PCR反应体系：10 × Easy Taq Buffer 2.5 μL，dNTP Mixture 2 μL，DNA模板1 μL，F/R引物各1 μL，5 U/μL Taq DNA polymorase 0.2 μL，用双蒸水补足至25 μL。扩增程序：95 ℃预变性4 min；95 ℃变性30 s，59 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，40个循环；最后72 ℃延伸5 min。此外，参考高天翔等[21]研究扩增Cyt b序列，PCR扩增产物送至广州金唯智公司完成测序。
1.4数据处理
使用MEGA 5.1软件对测序结果进行拼接、校正后，分析2个群体各自的碱基组成；使用DNASP软件计算2代群体的多态性位点，变异位点（variable sites），单倍型（haplotypes，h），单倍型多样性（haplotype diversity，Hd），核苷酸多样性（nucleotide diversity，Nd），平均核苷酸差异数（average number nucleotide differences，k）。
2结果与分析
2.1序列组成
所得D-loop（MF973238～MF973277）和Cyt b（MG018259～MG018298）序列各40条，经校正后长度分别为707～709 bp和404 bp，与NCBI数据库比对一致性均>98%，确认为大海马序列。东山岛和泉州市大海马（各20条）
Cyt b序列T、C、A、G含量一致，分别为30.4%、14.6%、30.4%、24.5%，2个群体Cyt b序列的第3位密码子G含量最少，第2位密码子G含量次之（表2）。20条东山岛大海马D-loop序列T、C、A、G含量分别为33.2%、13.9%、32.0%、20.9%，20条泉州市大海马D-loop序列T、C、A、G含量分别为33.3%、13.9%、31.9%、20.9%。D-loop和Cyt b序列中G+C含量明显低于A+T含量，C含量均低于G含量。
2.2遗传变异
由表3可知，20条东山岛大海马D-loop序列存在变异位点4个，共定义了3种单倍型，其中有18个个体属于同种单倍型，单倍型多样性为0.195±0.115，核苷酸多样性为0.000 69，核苷酸差异数为0.489，20条泉州市大海马D-loop序列变异位点7个，6种单倍型，有13个个体属于同种单倍型，单倍型多样性为0.579±0.124，核苷酸多样性为0.001 36，核苷酸差异数为0.958；东山岛和泉州市的Cyt b序列相似度为100%，单倍型只有1个，序列变异位点、单倍型多样性、核苷酸多样性、核苷酸差异数均为0。2种序列分析结果显示2个养殖场的大海马群体属于低单倍型（h<0.5）且低核苷酸多样性（Nd<0.5%）的群体，与D-loop序列分析结果相比，基于Cyt b序列分析东山岛和泉州市2个养殖场的大海马群体遗传变异水平更低。
3结论与讨论
该试验大海马D-loop和Cyt b序列存在明显的碱基偏倚性，与其他鱼类的研究结果相似，如贺亮等[19]研究发现2 种虾虎鱼A+T含量均高于 C+G 含量，邓朝阳[34]研究中鲫鱼Cyt b 和 D-loop 序列A+T含量也高于 G+C含量，这种偏倚性是大多数脊椎动物线粒体基因的共同特征，有研究者认为这种偏倚性是由于序列中的碱基置换具有倾向性[35]，编码基因的变异是由于密码子的简并性变异积累而成[36]。该试验大海马D-loop和Cyt b序列十分保守，2个群体之间序列差异很小，变异位点数均为1%以下，与其他物种研究结果存在很大差异[12，16，18]，同样，Lourie等[32，37]也发现华莱士线以西的三斑海马（Hippocampus trimaculatus）和亚洲东南部的大海马Cyt b序列变异较小的现象；Sanders等[38]也发现美国加利福尼亚海马D-loop和Cyt b序列进化速率都很低，表明海马D-loop和Cyt b序列与其他物种进化速率不一致。东山岛和泉州市2个大海马群体的D-loop和Cyt b序列保守性与大海马繁殖方式和生活习性有关，大海马的繁殖方式非常独特，因为雌海马把卵产在雄海马的育儿袋内，雄海马孵化出幼海马后没有精力照料和保护幼海马，造成小海马的成活率极低，这种低存活率会造成遗传漂变，进而影响线粒体进化速率。
群体遗传多样性的分子标记很多，但不同的分子标记适用性存在差异。变异位点、核苷酸多样性等参数在一定程度上可以判断一个群体的遗传多样性水平[39]。该研究结合Cyt b和D-loop序列对东山岛和泉州市的大海马群体进行分析发现单倍型多样性（Hd<0.5）和核苷酸多样性（Nd<0.5%）很低，变异位点数为0～7，说明大海马群体遗传变异较小。同样，在很多其他海马的研究中也发现类似的情况，例如太平洋海马（Hippocampus ingens）[30]、日本海馬（Hippocampus japonicus）[33]、短吻海马（Hippocampus guttulatus）[40]、南非海马（Hippocampus capensis）[31] 等其他几种海马的遗传多样性也处于低水平，但与该试验结果相比其遗传变异较大，而且其高单倍型多样性且低核苷酸多样性的遗传多样性模式与该试验模式不一样。一般认为，低单倍型多样性且低核苷酸多样性的遗传多样性模式是因为群体在近期养殖过程中产生了种群瓶颈效应或者奠基者效应。该试验大海马属于养殖品种，遗传变异较小可能是受到人工养殖影响[41-42]，要确定遗传变异较小是否与养殖有关，必须与养殖前的群体进行比较，此外，不同的物种类别遗传多样性必然有差异，海马的特殊繁殖方式在遗传变异中有限制进化速率的作用。结合其他人研究结果推测，海马线粒体序列比较保守，D-loop和Cyt b序列检测到的变异位点有限，检测其遗传多样性需要结合SNP和微卫星等技术。遗传物质变异积累的遗传多样性不仅决定物种的环境适应能力，而且对群体的种质变化有决定性意义，遗传变异越大，一个群体遗传多样性越丰富，该群体的生存能力就越强，群体数量也越多，反之群体数量越少。因此，基于该试验获取的D-loop和Cyt b序列分析显示福建东山岛和泉州市2地的大海马群体遗传变异较小，在一定程度上也反映了该地区海马种质稀缺的现象。在养殖过程中，应在优质的基础群体条件下，尽可能加大养殖基础群体和避免近亲繁殖才能维持较高的群体遗传多样性。 参考文献
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