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摘要：SSR标记法已经被广泛应用到水稻品种真实性的鉴定中，此方法具有快速、稳定等特点。本研究对比了不同退火温度、DNA聚合酶以及PCR扩增仪等因素对水稻品种真实性SSR分子检测方法的影响，旨在探讨如何根据实验室自身情况选择适合的反应体系和反应条件来顺利地开展检测工作。结果表明，55 ℃退火温度的PCR产物较有利于水稻品种真实性SSR标记的检测；2种PCR仪性能比较一致，均适合水稻品种真实性SSR标记的检测；TaKaRa及生工Taq DNA聚合酶均适合水稻品种真实性SSR标记的检测，天根Taq DNA聚合酶不适合水稻品种真实性SSR标记的检测。不同实验室，应选择以上3个适合实验条件进行组合，以提高水稻品种真实性和纯度分子检测的准确性。
关键词：水稻；SSR；品种真实性检测；退火温度；PCR扩增仪；DNA聚合酶
中图分类号： S511.01 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2016）11-0057-03
SSR称为简单重复序列（simple sequence repeat），也可以称为微卫星DNA（microsatellite DNA）。SSR是由1～6个核苷酸为重复序列组成的串联重复序列，这些简单重复序列随机、均匀，并且广泛存在于真核生物的基因组上[1] 。分子标记（molecular markers）是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映。以这种简单重复序列为基础的标记技术被称为分子标记技术，SSR分子标记由Moore等于1991年创立[2]。由于SSR分子标记具有非组织和发育阶段特异性、不易受外界环境影响、多态性高、在基因组中分布广泛、呈共显性遗传等优点，目前已经被广泛应用在农作物品种的真实性鉴定和纯度鉴定中[3-6]。2014年我国农业部修订了2007年版本的水稻品种鉴定标准，发布了行业推荐标准 NY/T 1433—2014 《水稻品种鉴定技术规程：SSR标记法》，因分子标记检测具有快速、稳定等特点，该技术规程在全国广泛应用；但是分子检测结果的可靠性和准确性，与实验条件和实验操作人员的实验技能有一定的关系，为提高江苏水稻品种真实性和纯度鉴定结果的准确性，本研究对江苏省种子管理站种子质量检验室现有的实验条件进行了组合比较，拟筛选较适合江苏水稻品种真实性和纯度鉴定的实验条件，在江苏范围内推广应用。
1 材料与方法
1.1 材料
以水稻品种淮稻5号和连粳7号为试验材料。
1.2 引物
选取NY/T 1433—2014《水稻品种鉴定技术规程：SSR标记法》（2014年6月1日实施）中12对SSR引物，引物名称及序列详见表1，引物由上海英俊生物技术有限公司合成。
1.3 试剂
（1）DNA提取：选用OMEGA公司生产的植物基因组DNA提取试剂盒（E.Z.N.A. TM Plant DNA Kit D3485-01）提取2个品种的DNA。
（2）Taq DNA聚合酶：选用TaKaRa公司、天根生物科技（北京）有限公司及生工生物工程（上海）股份有限公司的Taq DNA聚合酶。
1.4 主要仪器
使用赛默飞世尔科技公司（Thermo Fisher Scientific）的NanoDrop 2000超微量分光光度计，检测提取的DNA模板的浓度和质量；分别用BIO-RAD公司生产的 My cycler和 Agilent Technologies公司生产的Sure Cycler 8800扩增仪进行PCR扩增；采用美国Bio-rad伯樂 GelDoc XR System凝胶成像系统对银染后的聚丙烯酰胺凝胶拍照。
1.5 DNA 模板准备
用试剂盒提取完DNA后，用超微量分光光度计检测2个品种的DNA模板浓度，将其分别稀释到相同浓度使用。
1.6 实验条件设计
本实验采用50 ℃、55 ℃及60 ℃ 3个退火温度和3种不同来源的Taq DNA聚合酶在2种PCR扩增仪上对2个品种的DNA模板PCR扩增，为便于标记图片和分析结果，分别对实验条件进行编号（表2），并按照表3的实验条件组合进行。
2 结果与分析
2.1 DNA模板质量检测与稀释
用DNA提取试剂盒提取的DNA模板，微量分光光度计检测后结果见表4。D280 nm是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长，D260 nm是核酸最高吸收峰的吸收波长，D230 nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长。纯DNA的D260 nm/D280 nm比值为1.8，纯DNA和 RNA的D260 nm/D230 nm比值为2.5。检测结果表明，所提取DNA 模版质量较高，蛋白质、RNA、多糖和酚类等杂质基本去除，能够满足进行SSR分子标记分析的质量要求（表4）。根据每个样品的原始DNA浓度，稀释至50 ng/μL 备用。
2.2 退火温度对品种真实性SSR标记扩增产物质量的影响
18个实验条件组合中有6组组合可比较3种不同温度下品种真实性SSR标记PCR产物的质量。分别为ⅠaA、ⅡaA、ⅢaA，ⅠaB、ⅡaB、ⅢaB，ⅠbA、ⅡbA、ⅢbA，ⅠbB、ⅡbB、ⅢbB，ⅠcA、ⅡcA、ⅢcA，ⅠcB、ⅡcB、ⅢcB。以ⅠaA、ⅡaA、ⅢaA，ⅠaB、ⅡaB、ⅢaB等2组组合电泳图谱（图1）为例，对PCR产物电泳谱带的清晰度比较可知，50 ℃退火温度非特异性产物较多，电泳谱带弥散背景较多；55 ℃退火温度，扩增特异性目标条带清晰，电泳谱带背景干净，便于后续的比较分析；60 ℃退火温度扩增特异性目标条带不及55 ℃退火温度扩增特异性目标条带清晰，且其他5组组合中也是如此，因此，以55 ℃退火温度的PCR产物较有利于水稻品种真实性SSR标记的检测。 2.2 不同扩增仪对品种真实性SSR标记PCR产物质量的影响
18个实验条件组合中有9组组合可比较2种不同品牌扩增仪的PCR产物的质量，分别为ⅠaA、ⅠaB，ⅠbA、ⅠbB，ⅠcA、ⅠcB，ⅡaA、ⅡaB，ⅡbA、ⅡbB，ⅡcA、ⅡcB，ⅢaA、ⅢaB，ⅢbA、ⅢbB，ⅢcA、ⅢcB。以其中2组组合ⅢbA、ⅢbB和ⅢcA、ⅢcB电泳图谱（图2）为例，结果表明无论是条带特性高低与否、背景清晰与否，仪器对结果的影响并不明显，其他几个组合的结果亦如此，本实验表明2种PCR仪性能比较一致，均适合水稻品种真实性SSR标记的检测。
2.3 不同品牌的Taq DNA聚合酶对品种真实性SSR标记方法检测结果的影响
18个实验条件组合中有6组组合可比较3种不同品牌的聚合酶扩增后的结果，分别为ⅠaA、ⅠbA、ⅠcA，ⅡaA、ⅡbA、ⅡcA，ⅢaA、ⅢbA、ⅢcA，ⅠaB、ⅠbB、ⅠcB，ⅡaB、ⅡbB、ⅡcB，ⅢaB、ⅢbB、ⅢcB。以ⅠaA、ⅠbA、ⅠcA和ⅠaB、ⅠbB、ⅠcB電泳图谱（图3）为例，TaKaRa及生工Taq DNA聚合酶的PCR产物电泳谱带特异性高，目标条带清楚、杂带少、背景清晰，便于后期的成像分析；天根Taq DNA聚合酶的PCR产物电泳谱带特异性尚可、目标条带较清楚，但杂带多、背景不清晰。其他几个组合的结果亦如此，本实验结果表明TaKaRa及生工Taq DNA聚合酶均适合水稻品种真实性SSR标记的检测，天根Taq DNA聚合酶不适合水稻品种真实性SSR标记的检测。
3 小结与讨论
在利用分子标记法鉴定品种真实性的方法中，一个重要环节是PCR的扩增，只有扩增出特异性高、杂质少的扩增产物，才能在后续聚丙烯酰胺凝胶电泳、染色后得到条带清晰、背景干净的指纹图谱，方便后续的读图、分析和鉴定。而影响PCR反映的条件主要分为2个方面：一是PCR体系和反应环境。本研究中主要对这2种影响因素中的Taq DNA聚合酶、退火温度以及不同公司的仪器进行了比较分析，结果表明，55 ℃ 退火温度的PCR产物较有利于水稻品种真实性SSR标记的检测；2种PCR仪性能比较一致，均适合水稻品种真实性SSR标记的检测；TaKaRa及生工Taq DNA聚合酶均适合水稻品种真实性SSR标记的检测。
综上所述，如果准备开展SSR标记法对水稻品种真实性进行鉴定，应根据所在实验室的具体情况对PCR的反应体系和反应环境等进行相应的预实验和对比，根据实验室的仪器设备和资金预算等多个方面，选择适合的条件以满足真实性室内分子检测工作开展的需要，保证鉴定结果的准确性。当然，SSR标记法也有着一些局限性，随着生物技术的飞速发展，新技术、新方法也将运用到品种真实性检测中，例如毛细管电泳法、荧光标记法、SNP分子标记法、芯片技术乃至二代、三代测序技术等[7-8]。但无论哪种新型技术，由于分子方法的结果有不可预见性，在检验室开展和应用一项技术前，都应该根据实验室的具体情况开展一系列的摸索和对比试验，只有这样才能保证实验室检测结果的稳定性、重演性、准确性，真正为农业主管部门、执法部门提供最快速、最有利的技术支撑，在种子市场净化乃至整个种业发展中发挥巨大的作用。
参考文献：
[1]罗 兵，孙海燕，徐港明，等. SSR分子标记研究进展[J]. 安徽农业科学，2013，41（12）：5210-5212，5246.
[2]Moore S S，Sargeant L L，King T J，et al. The conservation of dinucleotide microsatellites among mammalian genomes allows the use of heterologous PCR primer pairs in closely related species[J]. Genomics，1991，10（3）：654-660.
[3]周 会，苏 秀，毛双林，等. 杂交水稻品种真实性和纯度的SSR分子标记鉴定[J]. 种子世界，2014（3）：34-35.
[4]张冰清，陆徐忠，吴新杰，等. 利用SSR标记进行杂交油菜品种鉴定[J]. 中国油料作物学报，2014，36（6）：728-734.
[5]王 飞. SSR分子标记在棉种真实性和纯度中的应用研究[D]. 北京：中国农业科学院，2013.
[6]郭奕生，何德银. SSR分子标记在玉米品种真实性鉴定上的应用[J]. 广东农业科学，2014，41（12）：12-15.
[7]许 鲲，李 锋，吴金锋，等. SSR荧光标记毛细管电泳法与国家冬油菜区试指纹鉴定平台的构建[J]. 中国油料作物学报，2014，36（2）：150-159.
[8]李 雪，田红丽，王凤格，等. SSR和SNP两种标记技术在玉米品种真实性鉴定中的比较分析[J]. 分子植物育种，2014，12（5）：1000-1004.
关键词：水稻；SSR；品种真实性检测；退火温度；PCR扩增仪；DNA聚合酶
中图分类号： S511.01 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2016）11-0057-03
SSR称为简单重复序列（simple sequence repeat），也可以称为微卫星DNA（microsatellite DNA）。SSR是由1～6个核苷酸为重复序列组成的串联重复序列，这些简单重复序列随机、均匀，并且广泛存在于真核生物的基因组上[1] 。分子标记（molecular markers）是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映。以这种简单重复序列为基础的标记技术被称为分子标记技术，SSR分子标记由Moore等于1991年创立[2]。由于SSR分子标记具有非组织和发育阶段特异性、不易受外界环境影响、多态性高、在基因组中分布广泛、呈共显性遗传等优点，目前已经被广泛应用在农作物品种的真实性鉴定和纯度鉴定中[3-6]。2014年我国农业部修订了2007年版本的水稻品种鉴定标准，发布了行业推荐标准 NY/T 1433—2014 《水稻品种鉴定技术规程：SSR标记法》，因分子标记检测具有快速、稳定等特点，该技术规程在全国广泛应用；但是分子检测结果的可靠性和准确性，与实验条件和实验操作人员的实验技能有一定的关系，为提高江苏水稻品种真实性和纯度鉴定结果的准确性，本研究对江苏省种子管理站种子质量检验室现有的实验条件进行了组合比较，拟筛选较适合江苏水稻品种真实性和纯度鉴定的实验条件，在江苏范围内推广应用。
1 材料与方法
1.1 材料
以水稻品种淮稻5号和连粳7号为试验材料。
1.2 引物
选取NY/T 1433—2014《水稻品种鉴定技术规程：SSR标记法》（2014年6月1日实施）中12对SSR引物，引物名称及序列详见表1，引物由上海英俊生物技术有限公司合成。
1.3 试剂
（1）DNA提取：选用OMEGA公司生产的植物基因组DNA提取试剂盒（E.Z.N.A. TM Plant DNA Kit D3485-01）提取2个品种的DNA。
（2）Taq DNA聚合酶：选用TaKaRa公司、天根生物科技（北京）有限公司及生工生物工程（上海）股份有限公司的Taq DNA聚合酶。
1.4 主要仪器
使用赛默飞世尔科技公司（Thermo Fisher Scientific）的NanoDrop 2000超微量分光光度计，检测提取的DNA模板的浓度和质量；分别用BIO-RAD公司生产的 My cycler和 Agilent Technologies公司生产的Sure Cycler 8800扩增仪进行PCR扩增；采用美国Bio-rad伯樂 GelDoc XR System凝胶成像系统对银染后的聚丙烯酰胺凝胶拍照。
1.5 DNA 模板准备
用试剂盒提取完DNA后，用超微量分光光度计检测2个品种的DNA模板浓度，将其分别稀释到相同浓度使用。
1.6 实验条件设计
本实验采用50 ℃、55 ℃及60 ℃ 3个退火温度和3种不同来源的Taq DNA聚合酶在2种PCR扩增仪上对2个品种的DNA模板PCR扩增，为便于标记图片和分析结果，分别对实验条件进行编号（表2），并按照表3的实验条件组合进行。
2 结果与分析
2.1 DNA模板质量检测与稀释
用DNA提取试剂盒提取的DNA模板，微量分光光度计检测后结果见表4。D280 nm是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长，D260 nm是核酸最高吸收峰的吸收波长，D230 nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长。纯DNA的D260 nm/D280 nm比值为1.8，纯DNA和 RNA的D260 nm/D230 nm比值为2.5。检测结果表明，所提取DNA 模版质量较高，蛋白质、RNA、多糖和酚类等杂质基本去除，能够满足进行SSR分子标记分析的质量要求（表4）。根据每个样品的原始DNA浓度，稀释至50 ng/μL 备用。
2.2 退火温度对品种真实性SSR标记扩增产物质量的影响
18个实验条件组合中有6组组合可比较3种不同温度下品种真实性SSR标记PCR产物的质量。分别为ⅠaA、ⅡaA、ⅢaA，ⅠaB、ⅡaB、ⅢaB，ⅠbA、ⅡbA、ⅢbA，ⅠbB、ⅡbB、ⅢbB，ⅠcA、ⅡcA、ⅢcA，ⅠcB、ⅡcB、ⅢcB。以ⅠaA、ⅡaA、ⅢaA，ⅠaB、ⅡaB、ⅢaB等2组组合电泳图谱（图1）为例，对PCR产物电泳谱带的清晰度比较可知，50 ℃退火温度非特异性产物较多，电泳谱带弥散背景较多；55 ℃退火温度，扩增特异性目标条带清晰，电泳谱带背景干净，便于后续的比较分析；60 ℃退火温度扩增特异性目标条带不及55 ℃退火温度扩增特异性目标条带清晰，且其他5组组合中也是如此，因此，以55 ℃退火温度的PCR产物较有利于水稻品种真实性SSR标记的检测。 2.2 不同扩增仪对品种真实性SSR标记PCR产物质量的影响
18个实验条件组合中有9组组合可比较2种不同品牌扩增仪的PCR产物的质量，分别为ⅠaA、ⅠaB，ⅠbA、ⅠbB，ⅠcA、ⅠcB，ⅡaA、ⅡaB，ⅡbA、ⅡbB，ⅡcA、ⅡcB，ⅢaA、ⅢaB，ⅢbA、ⅢbB，ⅢcA、ⅢcB。以其中2组组合ⅢbA、ⅢbB和ⅢcA、ⅢcB电泳图谱（图2）为例，结果表明无论是条带特性高低与否、背景清晰与否，仪器对结果的影响并不明显，其他几个组合的结果亦如此，本实验表明2种PCR仪性能比较一致，均适合水稻品种真实性SSR标记的检测。
2.3 不同品牌的Taq DNA聚合酶对品种真实性SSR标记方法检测结果的影响
18个实验条件组合中有6组组合可比较3种不同品牌的聚合酶扩增后的结果，分别为ⅠaA、ⅠbA、ⅠcA，ⅡaA、ⅡbA、ⅡcA，ⅢaA、ⅢbA、ⅢcA，ⅠaB、ⅠbB、ⅠcB，ⅡaB、ⅡbB、ⅡcB，ⅢaB、ⅢbB、ⅢcB。以ⅠaA、ⅠbA、ⅠcA和ⅠaB、ⅠbB、ⅠcB電泳图谱（图3）为例，TaKaRa及生工Taq DNA聚合酶的PCR产物电泳谱带特异性高，目标条带清楚、杂带少、背景清晰，便于后期的成像分析；天根Taq DNA聚合酶的PCR产物电泳谱带特异性尚可、目标条带较清楚，但杂带多、背景不清晰。其他几个组合的结果亦如此，本实验结果表明TaKaRa及生工Taq DNA聚合酶均适合水稻品种真实性SSR标记的检测，天根Taq DNA聚合酶不适合水稻品种真实性SSR标记的检测。
3 小结与讨论
在利用分子标记法鉴定品种真实性的方法中，一个重要环节是PCR的扩增，只有扩增出特异性高、杂质少的扩增产物，才能在后续聚丙烯酰胺凝胶电泳、染色后得到条带清晰、背景干净的指纹图谱，方便后续的读图、分析和鉴定。而影响PCR反映的条件主要分为2个方面：一是PCR体系和反应环境。本研究中主要对这2种影响因素中的Taq DNA聚合酶、退火温度以及不同公司的仪器进行了比较分析，结果表明，55 ℃ 退火温度的PCR产物较有利于水稻品种真实性SSR标记的检测；2种PCR仪性能比较一致，均适合水稻品种真实性SSR标记的检测；TaKaRa及生工Taq DNA聚合酶均适合水稻品种真实性SSR标记的检测。
综上所述，如果准备开展SSR标记法对水稻品种真实性进行鉴定，应根据所在实验室的具体情况对PCR的反应体系和反应环境等进行相应的预实验和对比，根据实验室的仪器设备和资金预算等多个方面，选择适合的条件以满足真实性室内分子检测工作开展的需要，保证鉴定结果的准确性。当然，SSR标记法也有着一些局限性，随着生物技术的飞速发展，新技术、新方法也将运用到品种真实性检测中，例如毛细管电泳法、荧光标记法、SNP分子标记法、芯片技术乃至二代、三代测序技术等[7-8]。但无论哪种新型技术，由于分子方法的结果有不可预见性，在检验室开展和应用一项技术前，都应该根据实验室的具体情况开展一系列的摸索和对比试验，只有这样才能保证实验室检测结果的稳定性、重演性、准确性，真正为农业主管部门、执法部门提供最快速、最有利的技术支撑，在种子市场净化乃至整个种业发展中发挥巨大的作用。
参考文献：
[1]罗 兵，孙海燕，徐港明，等. SSR分子标记研究进展[J]. 安徽农业科学，2013，41（12）：5210-5212，5246.
[2]Moore S S，Sargeant L L，King T J，et al. The conservation of dinucleotide microsatellites among mammalian genomes allows the use of heterologous PCR primer pairs in closely related species[J]. Genomics，1991，10（3）：654-660.
[3]周 会，苏 秀，毛双林，等. 杂交水稻品种真实性和纯度的SSR分子标记鉴定[J]. 种子世界，2014（3）：34-35.
[4]张冰清，陆徐忠，吴新杰，等. 利用SSR标记进行杂交油菜品种鉴定[J]. 中国油料作物学报，2014，36（6）：728-734.
[5]王 飞. SSR分子标记在棉种真实性和纯度中的应用研究[D]. 北京：中国农业科学院，2013.
[6]郭奕生，何德银. SSR分子标记在玉米品种真实性鉴定上的应用[J]. 广东农业科学，2014，41（12）：12-15.
[7]许 鲲，李 锋，吴金锋，等. SSR荧光标记毛细管电泳法与国家冬油菜区试指纹鉴定平台的构建[J]. 中国油料作物学报，2014，36（2）：150-159.
[8]李 雪，田红丽，王凤格，等. SSR和SNP两种标记技术在玉米品种真实性鉴定中的比较分析[J]. 分子植物育种，2014，12（5）：1000-1004.