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【摘要】 目的 主要研究E6AP与P53在宫颈癌中的表达及其意义。方法 对45例宫颈癌、10例CIN及10例正常宫颈组织标本采用免疫组化法检测P53蛋白，RT-PCR技术检测E6AP基因的表达。结果 宫颈癌和CIN组织中P53蛋白表达的阳性率明显高于正常宫颈，差异有统计学意义。E6AP基因在宫颈癌组织中表达高于CIN及正常宫颈组织，E6AP的表达水平随临床分期的进展而升高。P53阳性宫颈癌组织中的表达明显高于阴性组织中的E6APmRNA表达，差异有统计学意义。结论 E6AP的表达与P53的表达关系密切，参与了宫颈上皮组织癌变的发生，并且在宫颈癌的发展中起重要作用。
【关键词】 ：细胞内的E6相关蛋白；p53蛋白；宫颈癌
宫颈癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，是引起女性癌症相关性死亡的重要原因。本文应用免疫组化方法检测宫颈癌中P53的表达，RT-PCR技术检测E6AP基因的表达，进而分析它们在宫颈癌变及发生、发展中的关系。
1 材料和方法
1.1 标本来源和处理 选取2010年6月至2012年6月大连医科大学附属第一医院妇产科手术切除和活检的宫颈癌患者标本45例，CIN患者10例、正常宫颈组织10例，患者取标本前均未接受放、化疗及免疫治疗。其中鳞癌41例，腺癌4例；按组织学分级：高分化19例，中分化19例，低分化7例；临床分期按FIGO2009年标准：Ⅰ期25例，Ⅱ期16例，Ⅲ期4例。36例行手术治疗，术后证实淋巴结转移8例，未转移28例。将所取标本组织分为两块，一块10%福尔马林固定，常规石蜡包埋切片；另一块经液氮速冻后，储存于-80℃保存备用。
1.2 免疫组化检测P53蛋白表达 按照免疫组化方法SP二步法进行，采用PBS液代替一抗作为阴性对照。结果判定标准：P53蛋白以胞浆、细胞核和核周缘出现棕黄色颗粒为阳性，根据染色强度及阳性细胞数量将阳性表达分为3级：①阳性细胞数5%-10%为弱阳性（+）；②阳性细胞数11%-50%为中度阳性（++）；③阳性细胞数>50%为强阳性（+++）。阳性细胞数<5%为阴性（-）。
1.3 RT-PCR技术检测E6APmRNA的表达 目的基因在Pubmed中得到序列号，通过Primer Premier 5.0软件设计E6AP及内参β-actin的引物。然后使用Taq酶试剂盒及引物进行PCR反应。以E6AP/β-actin光密度比值作为E6APmRNA的表达水平。
1.4 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件包进行分析，采用计数资料采用Χ2检验，计量资料采用t检验。
2 结 果
2.1 P53蛋白的表达 45例宫颈癌组织中，P53阳性表达21例，阳性表达率为46.7%，其中鳞癌有19例（46.3%）、腺癌2例（50%）。比较不同宫颈癌组织学类型中P53蛋白表达，无显著差异（P>0.05）。P53蛋白在10例CIN组织中5例阳性，阳性率50%。10例正常宫颈组织中1例阳性（10%）。P53蛋白在宫颈癌组织与CIN组织中阳性表达相比较无明显差异（P>0.05）。但宫颈癌、CIN与正常宫颈组织相比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。
2.2 E6APmRNA的表达 45例宫颈癌组织中，19例E6AP基因有表达，10例CIN组织中3例有表达，10例正常组织中2例有表达，表达率分别为42.2%、30.0%和20.0%。统计学分析表明，宫颈癌组的E6APmRNA表达量高于正常组和CIN组，差异有统计学意义（P<0.05）。由此可知E6AP基因在正常和CIN组织中均有表达，但在癌性组织明显增加。比较P53蛋白不同表达的组织中E6APmRNA的表达，P53阳性宫颈癌组织中的表达（0.0957±0.0623）明显高于阴性组织中的E6APmRNA表达（0.0072±0.0093），差异有统计学意义（P<0.05）。
2.3 E6AP基因的表达与肿瘤的关系 根据肿瘤不同的临床病理特征研究发现，临床分期Ⅰ、Ⅱ期与Ⅲ期之间比较，Ⅲ期E6AP的表达水平明显升高，具有显著差异性（P<0.05）。而宫颈癌E6AP基因的表达在组织学分型、组织学分级、淋巴结转移各组间均无差异。
3 讨 论
P53基因是细胞内重要的肿瘤抑制基因和凋亡调节基因。当P53突变时，可导致肿瘤的发生。有研究表明P53蛋白过表达与宫颈癌的发生，及分化程度关系密切[1]，在宫颈癌发生、发展中起重要作用。宫颈癌中p53蛋白功能失活主要是通过HPVE6，利用E6AP泛素依赖途径降解的，同时也抑制P53介导的细胞凋亡[2]。本研究通过免疫组化及RT-PCR技术探讨E6AP表达与P53的关系及其在宫颈癌发生、发展过程中的意义。研究表明，E6AP的表达与P53的表达关系密切，参与了宫颈上皮组织癌变的发生，并且在宫颈癌的发展中起重要作用。目前关于E6AP基因与宫颈癌的关系的研究大多处于对基础的研究阶段。本实验从mRNA水平研究了E6AP在不同宫颈组织的表达与临床病理特征的关系，我们的研究认为E6AP参与了宫颈癌的发生、发展，E6AP选择性抑制剂可能会成为预防宫颈癌的一种新策略。
参考文献
[1] 郎爽，孔繁斗，吕申，等.hMLH1、P27、P53 的表达及其在宫颈癌发病中的意义[J].中国微生态学杂志，2006，18（6）：451- 453.
[2] Zanier K，Charbonnier S，Baltzinger M，et al.Kinetic analysis of the interactions of human PaPillomavirus E6 oncoProteins with the ubiquitin ligase E6AP using surface Plasmon resonance[J].J Mol Biol，2005，349（2）：401-413.
【关键词】 ：细胞内的E6相关蛋白；p53蛋白；宫颈癌
宫颈癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，是引起女性癌症相关性死亡的重要原因。本文应用免疫组化方法检测宫颈癌中P53的表达，RT-PCR技术检测E6AP基因的表达，进而分析它们在宫颈癌变及发生、发展中的关系。
1 材料和方法
1.1 标本来源和处理 选取2010年6月至2012年6月大连医科大学附属第一医院妇产科手术切除和活检的宫颈癌患者标本45例，CIN患者10例、正常宫颈组织10例，患者取标本前均未接受放、化疗及免疫治疗。其中鳞癌41例，腺癌4例；按组织学分级：高分化19例，中分化19例，低分化7例；临床分期按FIGO2009年标准：Ⅰ期25例，Ⅱ期16例，Ⅲ期4例。36例行手术治疗，术后证实淋巴结转移8例，未转移28例。将所取标本组织分为两块，一块10%福尔马林固定，常规石蜡包埋切片；另一块经液氮速冻后，储存于-80℃保存备用。
1.2 免疫组化检测P53蛋白表达 按照免疫组化方法SP二步法进行，采用PBS液代替一抗作为阴性对照。结果判定标准：P53蛋白以胞浆、细胞核和核周缘出现棕黄色颗粒为阳性，根据染色强度及阳性细胞数量将阳性表达分为3级：①阳性细胞数5%-10%为弱阳性（+）；②阳性细胞数11%-50%为中度阳性（++）；③阳性细胞数>50%为强阳性（+++）。阳性细胞数<5%为阴性（-）。
1.3 RT-PCR技术检测E6APmRNA的表达 目的基因在Pubmed中得到序列号，通过Primer Premier 5.0软件设计E6AP及内参β-actin的引物。然后使用Taq酶试剂盒及引物进行PCR反应。以E6AP/β-actin光密度比值作为E6APmRNA的表达水平。
1.4 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件包进行分析，采用计数资料采用Χ2检验，计量资料采用t检验。
2 结 果
2.1 P53蛋白的表达 45例宫颈癌组织中，P53阳性表达21例，阳性表达率为46.7%，其中鳞癌有19例（46.3%）、腺癌2例（50%）。比较不同宫颈癌组织学类型中P53蛋白表达，无显著差异（P>0.05）。P53蛋白在10例CIN组织中5例阳性，阳性率50%。10例正常宫颈组织中1例阳性（10%）。P53蛋白在宫颈癌组织与CIN组织中阳性表达相比较无明显差异（P>0.05）。但宫颈癌、CIN与正常宫颈组织相比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。
2.2 E6APmRNA的表达 45例宫颈癌组织中，19例E6AP基因有表达，10例CIN组织中3例有表达，10例正常组织中2例有表达，表达率分别为42.2%、30.0%和20.0%。统计学分析表明，宫颈癌组的E6APmRNA表达量高于正常组和CIN组，差异有统计学意义（P<0.05）。由此可知E6AP基因在正常和CIN组织中均有表达，但在癌性组织明显增加。比较P53蛋白不同表达的组织中E6APmRNA的表达，P53阳性宫颈癌组织中的表达（0.0957±0.0623）明显高于阴性组织中的E6APmRNA表达（0.0072±0.0093），差异有统计学意义（P<0.05）。
2.3 E6AP基因的表达与肿瘤的关系 根据肿瘤不同的临床病理特征研究发现，临床分期Ⅰ、Ⅱ期与Ⅲ期之间比较，Ⅲ期E6AP的表达水平明显升高，具有显著差异性（P<0.05）。而宫颈癌E6AP基因的表达在组织学分型、组织学分级、淋巴结转移各组间均无差异。
3 讨 论
P53基因是细胞内重要的肿瘤抑制基因和凋亡调节基因。当P53突变时，可导致肿瘤的发生。有研究表明P53蛋白过表达与宫颈癌的发生，及分化程度关系密切[1]，在宫颈癌发生、发展中起重要作用。宫颈癌中p53蛋白功能失活主要是通过HPVE6，利用E6AP泛素依赖途径降解的，同时也抑制P53介导的细胞凋亡[2]。本研究通过免疫组化及RT-PCR技术探讨E6AP表达与P53的关系及其在宫颈癌发生、发展过程中的意义。研究表明，E6AP的表达与P53的表达关系密切，参与了宫颈上皮组织癌变的发生，并且在宫颈癌的发展中起重要作用。目前关于E6AP基因与宫颈癌的关系的研究大多处于对基础的研究阶段。本实验从mRNA水平研究了E6AP在不同宫颈组织的表达与临床病理特征的关系，我们的研究认为E6AP参与了宫颈癌的发生、发展，E6AP选择性抑制剂可能会成为预防宫颈癌的一种新策略。
参考文献
[1] 郎爽，孔繁斗，吕申，等.hMLH1、P27、P53 的表达及其在宫颈癌发病中的意义[J].中国微生态学杂志，2006，18（6）：451- 453.
[2] Zanier K，Charbonnier S，Baltzinger M，et al.Kinetic analysis of the interactions of human PaPillomavirus E6 oncoProteins with the ubiquitin ligase E6AP using surface Plasmon resonance[J].J Mol Biol，2005，349（2）：401-413.