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背景:成纤维细胞是构建组织工程化皮肤的种子细胞,其质量好坏直接影响组织工程化皮肤的质量。其在体外培养过程中胶原基因表达及对表皮细胞生长因子刺激反应,可以反映不同代次成纤维细胞的增殖能力,为皮肤组织工程筛选合适的种子细胞提供依据。目的:观察体外培养不同代次人成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原基因的表达及对表皮细胞生长因子刺激的反应性,为组织工程化皮肤种子细胞的选择提供部分依据和参数。设计:自身对照实验。单位:潍坊医学院整形外科研究所。材料:实验于2000-09/2002-06在潍坊医学院整形外科研究所完成。实验样本来源于在潍坊医学院附属医院普外科行包皮环切术的6～8岁正常男性儿童(n=20)切除的健康包皮组织,均自愿提供。方法:①成纤维细胞培养:取包皮组织,去除皮下疏松结缔组织,分离真皮和表皮,真皮部分用含100mL/L胎牛血清DMEM培养液终止胰蛋白酶作用,再用200U/mLⅠ型胶原酶37℃条件下消化30min,收集细胞悬液,用血细胞计数板做细胞计数,观察细胞活性,接种于培养皿中,细胞培养达到80%汇合时,用混合消化液消化,镜下见胞质回缩终止消化,以1:2接种入新培养皿,进行传代培养。②细胞鉴定:用相差显微镜动态观察细胞形态变化及生长增殖情况、透射电镜及抗vimentin免疫细胞化学染色。③不同代次成纤维细胞胶原基因表达的分析:抽提不同代次(P0,P5,…,P65)成纤维细胞总核糖核酸,获得样本cDNA,进行逆转录聚合酶链反应,所得反应产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳对照分子量标准,分析扩增产物是否为所预期。④氚-胸苷(3H-TdR)掺入量测定对表皮生长因子刺激的反应性:取P10和P60代成纤维细胞,实验组均添加含表皮生长因子的条件培养液,对照组用不加表皮生长因子的条件培养液。细胞培养至80%汇合时,血清饥饿72h。加入含200μL/L表皮生长因子无血清DMEM培养液,培养24h;弃上清,各组均加入含氚-胸苷的培养液37MBq/L,再培养24h,收集细胞;用预冷的100g/L三氯乙酸沉淀DNA,再用0.5mL1mol/LNaOH提取,液闪计数仪上测定每分钟放射性脉冲数。主要观察指标:①不同代次成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA含量。②不同代次成纤维细胞对表皮细胞生长因子刺激的反应。结果:①不同代次成纤维细胞胶原基因的表达:随细胞代次的增加,Ⅰ,Ⅲ型胶原mRNA含量逐渐降低。②不同代次成纤维细胞对表皮细胞生长因子刺激的反应:氚-胸苷掺入量在P60细胞(实验组:132.5±23.6,对照组:124.9±16.8)均低于在P10细胞中(实验组:512.8±56.4,对照组:306.4±22.5);对于P60细胞,实验组与对照组间差异无显著性意义(P>0.05),对于P10细胞,实验组与对照组间的差异有非常显著性意义(P<0.01)。结论:①随成纤维细胞代龄的增加,其合成Ⅰ型和Ⅲ型胶原的量逐渐降低。②P60细胞对表皮细胞生长因子刺激的反应均低于P10细胞,添加表皮细胞生长因子的条件培养液对P60细胞生长增殖无明显调控作用,对P10细胞有非常显著的促增殖作用。提示:随着细胞代次的增加,氚-胸苷掺入量降低,表皮细胞生长因子对衰老成纤维细胞生长增殖的调控能力减弱。③本实验为建立成纤维细胞衰老模型提供了实验依据,同时也为组织工程学、老年学及肿瘤生物学及发展提供科学依据。