论文部分内容阅读
目的:观察蛇床子素(OST)对破骨细胞(OC)分化成熟的影响,研究其作用的分子机制;以探究蛇床子素抗骨质疏松的作用机制。方法:通过大鼠骨髓单核细胞建立破骨细胞诱导培养体系:采用特殊的骨髓单核细胞提取装置分离骨髓单核细胞;观察骨髓单核细胞生长的形态学特征;通过CCK-8法观察骨髓单核细胞的生长特性;通过流式细胞法验证通过此方法获得的单核细胞纯度;通过抗酒石酸酸性磷酸酶染色法(TRAP)和降钙素受体(CTR)免疫荧光染色鉴定破骨细胞;通过小鼠RAW264.7细胞系构建破骨细胞诱导培养体系:观察RAW264.7细胞系生长的形态学特征;通过TRAP染色法鉴定破骨细胞;使用CCK-8法筛选出对骨髓单核细胞和RAW264.7细胞系均无细胞毒性的10-6mol/L、10-5mol/L浓度组,以溶剂对照组(DMSO)为阴性组,核因子κB受体活化因子配基(RANKL)组为对照组;使用TRAP染色法观察OST对两种细胞向破骨细胞分化时TRAP阳性细胞数、融合指数的变化;使用骨陷窝的甲苯胺蓝染色和扫描电镜法观察两种细胞向破骨细胞分化过程中骨陷窝的个数、总面积和平均面积的变化;使用细胞骨架肌动蛋白环(FITC-Phalloidin)荧光染色法观察OST对骨髓单核细胞诱导而来的破骨细胞形态结构的影响;使用吖啶橙染色法观察OST对骨髓单核细胞诱导而来的破骨细胞凋亡的影响;使用荧光素酶报告基因法观察OST对RAW264.7细胞系中转录因子NFAT和NF-κB的表达情况的影响;应用q-PCR技术检测OST对RAW264.7细胞系中相关破骨基因NFATcl、CTSK、MMP-9、TRAP、INTE-BETA3、C-SRC 表达的影响;应用 Western blotting技术检测OST对RAW264.7细胞系中NF-κB信号通路上相关蛋白膜p65、IκB、p-IκB、核p65表达的影响。结果:成功建立大鼠骨髓单核细胞诱导破骨细胞的培养体系;大鼠骨髓单核细胞可在体外稳定增殖一周左右的时间;流式细胞术结果显示CD11b在原代大鼠骨髓单核细胞中的表达率高达98.6%,纯度较高;并通过TRAP染色和CTR免疫荧光染色成功鉴定;成功建立小鼠RAW264.7细胞系诱导破骨细胞的培养体系;并通过TRAP染色法成功鉴定。OST可以明显抑制骨髓单核细胞和RAW264.7细胞系在RANKL刺激下生成的TRAP阳性细胞数和融合指数,差异均有统计学意义(P<0.05),且两浓度组间比较差异也有统计学意义(P<0.05);OST可以抑制骨髓单核细胞和RAW264.7细胞系诱导分化过程中骨陷窝个数和骨陷窝总面积,差异有统计学意义(P<0.05),骨髓单核细胞的骨陷窝平均面积OST组较对照组减少,差异有统计学意义(P<0.05),但两浓度组间无差异(P>0.05)。RAW264.7细胞系的骨陷窝平均面积几组间均无统计学差异(P>0.05);OST还可以抑制骨髓单核细胞分化成的破骨细胞功能结构的出现;另外,OST可以促进骨髓单核细胞分化成的破骨细胞的凋亡,且高浓度组促凋亡效果更好,差异均有统计学意义(P<0.05)。OST还可以明显抑制转录因子NFAT和NF-κB的启动,同时也下调下游基因的表达,OST组的荧光值与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05),但抑制效果仍然不如阳性对照组;OST 还可以抑制 NFATc1、CTSK、MMP-9、TRAP、INTE-BETA3、C-SRC 这些破骨特异性基因的表达,除了 Integrin-BETA3、C-SRC外,两浓度组组间比较,差异均有统计学意义(P<0.05);另外,OST可以使得NF-κB信号通路上的IκB的磷酸化和NF-κB p65向细胞核转位,抑制NF-κB信号通路上相关蛋白的表达。结论:本研究证实了蛇床子素可以通过抑制NF-κB信号通路的表达而引起NFATc1等相关转录因子的下调来抑制破骨细胞的分化成熟。且OST抑制破骨细胞分化的最佳浓度区间在10-6mol/L-10-5mol/L,为以蛇床子素为有效成分的新药研究进一步奠定了基础。