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[摘要] 目的 定量检测中枢神经系统白血病患者脑脊液循环DNA的含量并探讨其临床意义。 方法 收集2014年8月～2015年7月间的急性白血病、中枢神经系统白血病治疗前、后患者各20例；留取同期非恶性血液肿瘤患者20例为对照组，微量DNA提取试剂盒提取脑脊液循环DNA，SYBR green荧光染色法测定脑脊液循环DNA浓度。结果 1.脑脊液循环DNA电泳条带在100～1000 bp之间。2.中枢神经系统白血病组循环DNA浓度为[（330.97±35.49）ng/mL]、急性白血病组循环DNA浓度为[（79.18 ±2.22）ng/mL]，均明显高于非恶性血液病组脑脊液循环 DNA 浓度[（7.83 ±1.85）ng/mL]（P=0.000；P=0.000）；中枢神经系统白血病患者治疗缓解后脑脊液循环DNA浓度[（141.77±37.56）ng/mL]明显低于治疗前组循环DNA浓度[（330.97±35.49）ng/mL]（P=0.000）。 结论 脑脊液循环DNA水平与中枢神经系统白血病细胞浸润具有明显相关性，在中枢神经系统白血病早期诊断及病情监测方面有一定的临床价值。
[关键词] 循环DNA；中枢神经系统白血病；脑脊液；肿瘤标志物
[中图分类号] R733.7 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）07-0019-03
[Abstract] Objective To quantify the circulating DNA in cerebrospinal fluid（CSF） from patients with CNSL and evaluate its potential clinical value. Methods Cerebrospinal fluid samples were collected from 20 patients with CNSL before Intrathecal chemotherapy， 20 patients with CNSL after Intrathecal chemotherapy，20 acute leukemia patients and 20 patients without hematological malignancy from August 2014 to July 2015. The cerebrospinal fluid DNA was extracted by commercial kit and detected by fluorescntmeter. Results 1.Circulating DNA electrophoresis bands were between 100～1000 bp. 2.Statistical significance（P=0.000； P=0.000） in mean circulating cerebrospinal fluid DNA levels were found between patients without hematological malignancy[（7.83±1.85）ng/mL] and patients with acute leukemia [（79.18±2.22）ng/mL]，with CNSL patients were[（330.97±35.49）ng/mL]. Circulating DNA levels of acute leukemia without CNSL after chemotherapy[（141.77±37.56）ng/mL] were less than without chemotherapy [（330.97±35.49）ng/mL]（P=0.000）. Conclusion The Circulating DNA levels significant correlated with central nervous system leukemia，it can initially predict the metastasis potential and prognosis of those CNSL patients.
[Key words] Circulating DNA； Central Nervous System Leukemia； Cerebrospinal fluid； Tumor marker
中枢神经系统白血病系白血病细胞浸润蛛网膜或蛛网膜邻近组织所致，是白血病复发的主要根源。中枢神经系统白血病早期无明显临床症状，主要依靠发病后脑脊液沉渣镜检诊断。该方法早期诊断率低。针对中枢神经系统白血病的少创伤、简便可靠以获得早期诊断成为研究目标。近年来循环DNA做为一种新型的肿瘤标志物在肿瘤疾病方面的研究[1，2]成为了热点。健康人的循环DNA主要来源于细胞凋亡，而恶性肿瘤患者的循环DNA主要由肿瘤细胞分泌及坏死、凋亡、微转移灶所释放[3]。故检测循环DNA含量用于恶性肿瘤早期诊断与治疗效果判断成为可能。定量检测中枢神经系统白血病患者脑脊液循环DNA的含量，旨在探讨脑脊液循环DNA含量在中枢神经系统白血病临床应用方面的价值。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2014年8月～2015年7月间急性白血病患者20例（男11例，女9例，平均年龄36.0岁），中枢神经系统白血病治疗前患者20例（男12例，女8例，平均年龄37.6岁）及治疗后患者（男11例，女9例，平均年龄37.3岁）20例；同期非恶性血液肿瘤患者20例（男11例，女9例，平均年龄38.2岁）为对照组。各组一般资料具有可比性。急性白血病诊断分型参照世界卫生组织（WHO）2008年公布的造血与淋巴系统肿瘤的诊断分型标准。中枢神经系统白血病诊断标准：①头部MR/CT（平扫 增强）浸润或块状病变；②能除外其他原因的颅神经瘫痪及视网膜浸润，及CSF、MR/CT未见异常，③CSF中有幼稚细胞，且WBC>5×10-9/L，除外腰穿损伤。诊断成立须符合以上至少一项。三联鞘注防治中枢神经系统白血病（药物剂量：地塞米松10 mg 阿糖胞苷50 mg 甲氨蝶呤15 mg）。入组病例均应排除其他恶性肿瘤，无类风湿关节炎等免疫性疾病，无外伤、肝肾等脏器损伤性疾病。 1.2 标本采集
急性白血病患者缓解后腰穿留取脑脊液1.5 mL，中枢神经系统白血病患者分别于确诊时与治疗缓解后腰穿留取脑脊液1.5 mL，非恶性血液肿瘤患者脑脊液常规检查留取1.5 mL。4℃、3000 r/min离心10 min，EP管收集上清液-80℃低温保存。
1.3 循环DNA提取
按照QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒（德同Qiagen公司）说明书所述方法提取循环DNA。紫外分光光度计NanoDrop 2000（Thermo Fisher Scientific公司，美国）初步检测提取纯度及效率，琼脂糖凝胶电泳分析循环DNA的完整性。
1.4 DNA定量
取1 μL纯化的脑脊液DNA，与等体积Picogreen荧光染料均匀混合，应用Qubit2.0荧光仪测定荧光值，计算DNA含量。
1.5 统计学处理
应用SPSS18.0统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示。两组间比较采用独立样本t检验，多个组样本均数之间比较用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 脑脊液中循环DNA的琼脂糖凝胶电泳结果
循环DNA琼脂糖凝胶片电泳，染色后紫外灯下直接观察循环DNA片段大小分布。其中CNSL组、CNSL治疗后组可见清晰条带。对照DNA mark电泳结果，循环DNA电泳条带在100～1000 bp之间。见图1。
2.2 对照组、急性白血病组患者脑脊液DNA含量
中枢神经系统白血病组循环DNA浓度为[（330.97±35.49）ng/mL]、急性白血病组循环DNA浓度为[（79.18±2.22）ng/mL]，均明显高于非恶性血液病组脑脊液循环 DNA 浓度[（7.83±1.85）ng/mL]差异有统计学意义（P=0.000）；中枢神经系统白血病患者治疗缓解后脑脊液循环DNA浓度[（141.77±37.56）ng/mL]明显低于治疗前组循环DNA浓度[（330.97±35.49）ng/mL]，差异有统计学意义（P=0.000）。中枢神经系统白血病患者治疗缓解后脑脊液循环DNA浓度[（141.77±37.56）ng/mL]仍明显高于急性白血病组循环DNA浓度[（79.18±2.22）ng/mL]，差异有统计学意义（P=0.000）。
3 讨论
循环DNA在1948年被发现，随后发现肿瘤患者的循环DNA与其肿瘤组织表现出共同的遗传学性状[4-8]。对循环DNA的来源研究表明肿瘤患者的循环 DNA 主要来源为肿瘤细胞主动分泌、坏死及凋亡、微转移灶等释放[3]。中枢神经系统白血病恶性增殖的白血病细胞及化疗药物导致的细胞坏死和凋亡，都可改变者脑脊液中的循环 DNA，因此脑脊液循环DNA的检测为我们早期诊断及治疗效果监测提供新的思路。
本研究循环DNA电泳分子量介于100 bp～1000 bp之间，与Stroun M[9]的研究结果相似。原因可能循环DNA的来源有关。健康人循环DNA主要来源于细胞凋亡，该来源的循环DNA片段较短，一般小于200 bp。肿瘤患者循环DNA则主要由肿瘤细胞坏死产生，其电泳出更长的循环DNA片段[3]。多种肿瘤患者循环DNA水平高于健康人，并表现出与肿瘤细胞相同的生物学特性[5-7]。目前为止，循环DNA来源机制仍不十分清楚。
我们采用Picogreen 荧光染色法[8]对循环 DNA 定量检测。结果显示患者中枢浸润后脑脊液循环DNA水平明显升高。既往研究表明多种实体肿瘤患者循环DNA 水平高于健康人[5-7，9]。关于白血病患者的研究也显示循环DNA水平升高[10，11]。Leon等[12]的研究显示肿瘤负荷高的患者循环DNA水平更高。恶性血液病循环 DNA 水平高于实体肿瘤，可能与体液中肿瘤细胞多有关，提示循环肿瘤细胞与循环 DNA 有一定的相关性，而循环肿瘤细胞与肿瘤转移相关[13，14]。国内恶性血液病循环 DNA研究较少，孙开胜[15]等采用 SYBR green 荧光染色法对急性白血病患者血循环 DNA 定量分析，发现发病后循环DNA升高。本研究比较急性白血病患者中枢浸润前后脑脊液循环 DNA 水平，发现两者之间有显著差异，结合急性白血病特点分析，导致本结果的可能有以下原因：急性白血病细胞定植中枢大量增殖导致循环DNA释放；血脑屏障阻止以蛋白结合形式的循环DNA进入外周血，避免被肝脏迅速代谢[8]。
化疗后肿瘤负荷降低，肿瘤细胞来源的循环 DNA随之减少，循环 DNA 水平下降[16]。我们比较中枢神经系统白血病患者化疗前、后脑脊液循环DNA 水平，发现治疗后较治疗前明显减少，治疗效果好的患者更明显，显示出其与病情变化明显相关。中枢神经系统白血病患者治疗后脑脊液循环DNA水平仍高于未合并中枢浸润患者，考虑化疗并不能完全清除肿瘤细胞，残留的白血病细胞仍能增加循环DNA的水平，这也可能与中枢神经系统白血病即使治疗后仍多见复发有关。
综上所述，定量检测中枢神经系统白血病患者诊治过程中循环DNA水平变化，中枢神经系统白血病发病后脑脊液循环DNA水平显著升高，治疗后明显下降。显示出对疾病的早期诊断及病情监测有一定的指导意义。通过对中枢神经系统白血病患者脑脊液循环DNA的检测，我们可以更早诊断及预测病情变化，具有较大的可行性。对循环DNA的研究，有可能为中枢神经系统白血病的早期诊断、病情监测提供特异性好、灵敏度高的新的预测指标。
[参考文献]
[1] Swaminathan R，Butt AN. Circulating nucleic acids in plasma and serum：recent developments[J]. Annals of the New York Academy of Sciences，2006，10（7）：1-9. [2] Gahan PB，Swaminathan R. Circulating nucleic acids in plasma and serum. Recent developments[J]. Annals of the New York Academy of Sciences，2008，11（3）：1-6.
[3] Board RE，Williams Vs Fau-Knight L，Knight L Fau-Shaw J，et al. Isolation and extraction of circulating tumor DNA from patients with small cell lung cancer[J]. Ann.N.Y.Acad.Sci，2008，11（3）：98-107.
[4] van der Vaart M，Pretorius PJ. A method for characterization of total circulating DNA[J]. Annals of the New York Academy of Sciences，2008，11（3）：92-97.
[5] Goebel G，Zitt M Fau，Muller HM，et al. Circulating nucleic acids in plasma or serum（CNAPS） as prognostic and predictive markers in patients with solid neoplasias[J]. Dis. Markers，2005，21（3）：105-120.
[6] Kandel ES. Mutations in circulating mitochondrial DNA：Cassandra of oral cancer？[J]. Oncotarget，2012，3（7）：664-665.
[7] Figg WD，2nd，Reid J. Monitor tumor burden with circulating tumor DNA[J]. Cancer biology
[关键词] 循环DNA；中枢神经系统白血病；脑脊液；肿瘤标志物
[中图分类号] R733.7 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）07-0019-03
[Abstract] Objective To quantify the circulating DNA in cerebrospinal fluid（CSF） from patients with CNSL and evaluate its potential clinical value. Methods Cerebrospinal fluid samples were collected from 20 patients with CNSL before Intrathecal chemotherapy， 20 patients with CNSL after Intrathecal chemotherapy，20 acute leukemia patients and 20 patients without hematological malignancy from August 2014 to July 2015. The cerebrospinal fluid DNA was extracted by commercial kit and detected by fluorescntmeter. Results 1.Circulating DNA electrophoresis bands were between 100～1000 bp. 2.Statistical significance（P=0.000； P=0.000） in mean circulating cerebrospinal fluid DNA levels were found between patients without hematological malignancy[（7.83±1.85）ng/mL] and patients with acute leukemia [（79.18±2.22）ng/mL]，with CNSL patients were[（330.97±35.49）ng/mL]. Circulating DNA levels of acute leukemia without CNSL after chemotherapy[（141.77±37.56）ng/mL] were less than without chemotherapy [（330.97±35.49）ng/mL]（P=0.000）. Conclusion The Circulating DNA levels significant correlated with central nervous system leukemia，it can initially predict the metastasis potential and prognosis of those CNSL patients.
[Key words] Circulating DNA； Central Nervous System Leukemia； Cerebrospinal fluid； Tumor marker
中枢神经系统白血病系白血病细胞浸润蛛网膜或蛛网膜邻近组织所致，是白血病复发的主要根源。中枢神经系统白血病早期无明显临床症状，主要依靠发病后脑脊液沉渣镜检诊断。该方法早期诊断率低。针对中枢神经系统白血病的少创伤、简便可靠以获得早期诊断成为研究目标。近年来循环DNA做为一种新型的肿瘤标志物在肿瘤疾病方面的研究[1，2]成为了热点。健康人的循环DNA主要来源于细胞凋亡，而恶性肿瘤患者的循环DNA主要由肿瘤细胞分泌及坏死、凋亡、微转移灶所释放[3]。故检测循环DNA含量用于恶性肿瘤早期诊断与治疗效果判断成为可能。定量检测中枢神经系统白血病患者脑脊液循环DNA的含量，旨在探讨脑脊液循环DNA含量在中枢神经系统白血病临床应用方面的价值。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2014年8月～2015年7月间急性白血病患者20例（男11例，女9例，平均年龄36.0岁），中枢神经系统白血病治疗前患者20例（男12例，女8例，平均年龄37.6岁）及治疗后患者（男11例，女9例，平均年龄37.3岁）20例；同期非恶性血液肿瘤患者20例（男11例，女9例，平均年龄38.2岁）为对照组。各组一般资料具有可比性。急性白血病诊断分型参照世界卫生组织（WHO）2008年公布的造血与淋巴系统肿瘤的诊断分型标准。中枢神经系统白血病诊断标准：①头部MR/CT（平扫 增强）浸润或块状病变；②能除外其他原因的颅神经瘫痪及视网膜浸润，及CSF、MR/CT未见异常，③CSF中有幼稚细胞，且WBC>5×10-9/L，除外腰穿损伤。诊断成立须符合以上至少一项。三联鞘注防治中枢神经系统白血病（药物剂量：地塞米松10 mg 阿糖胞苷50 mg 甲氨蝶呤15 mg）。入组病例均应排除其他恶性肿瘤，无类风湿关节炎等免疫性疾病，无外伤、肝肾等脏器损伤性疾病。 1.2 标本采集
急性白血病患者缓解后腰穿留取脑脊液1.5 mL，中枢神经系统白血病患者分别于确诊时与治疗缓解后腰穿留取脑脊液1.5 mL，非恶性血液肿瘤患者脑脊液常规检查留取1.5 mL。4℃、3000 r/min离心10 min，EP管收集上清液-80℃低温保存。
1.3 循环DNA提取
按照QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒（德同Qiagen公司）说明书所述方法提取循环DNA。紫外分光光度计NanoDrop 2000（Thermo Fisher Scientific公司，美国）初步检测提取纯度及效率，琼脂糖凝胶电泳分析循环DNA的完整性。
1.4 DNA定量
取1 μL纯化的脑脊液DNA，与等体积Picogreen荧光染料均匀混合，应用Qubit2.0荧光仪测定荧光值，计算DNA含量。
1.5 统计学处理
应用SPSS18.0统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示。两组间比较采用独立样本t检验，多个组样本均数之间比较用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 脑脊液中循环DNA的琼脂糖凝胶电泳结果
循环DNA琼脂糖凝胶片电泳，染色后紫外灯下直接观察循环DNA片段大小分布。其中CNSL组、CNSL治疗后组可见清晰条带。对照DNA mark电泳结果，循环DNA电泳条带在100～1000 bp之间。见图1。
2.2 对照组、急性白血病组患者脑脊液DNA含量
中枢神经系统白血病组循环DNA浓度为[（330.97±35.49）ng/mL]、急性白血病组循环DNA浓度为[（79.18±2.22）ng/mL]，均明显高于非恶性血液病组脑脊液循环 DNA 浓度[（7.83±1.85）ng/mL]差异有统计学意义（P=0.000）；中枢神经系统白血病患者治疗缓解后脑脊液循环DNA浓度[（141.77±37.56）ng/mL]明显低于治疗前组循环DNA浓度[（330.97±35.49）ng/mL]，差异有统计学意义（P=0.000）。中枢神经系统白血病患者治疗缓解后脑脊液循环DNA浓度[（141.77±37.56）ng/mL]仍明显高于急性白血病组循环DNA浓度[（79.18±2.22）ng/mL]，差异有统计学意义（P=0.000）。
3 讨论
循环DNA在1948年被发现，随后发现肿瘤患者的循环DNA与其肿瘤组织表现出共同的遗传学性状[4-8]。对循环DNA的来源研究表明肿瘤患者的循环 DNA 主要来源为肿瘤细胞主动分泌、坏死及凋亡、微转移灶等释放[3]。中枢神经系统白血病恶性增殖的白血病细胞及化疗药物导致的细胞坏死和凋亡，都可改变者脑脊液中的循环 DNA，因此脑脊液循环DNA的检测为我们早期诊断及治疗效果监测提供新的思路。
本研究循环DNA电泳分子量介于100 bp～1000 bp之间，与Stroun M[9]的研究结果相似。原因可能循环DNA的来源有关。健康人循环DNA主要来源于细胞凋亡，该来源的循环DNA片段较短，一般小于200 bp。肿瘤患者循环DNA则主要由肿瘤细胞坏死产生，其电泳出更长的循环DNA片段[3]。多种肿瘤患者循环DNA水平高于健康人，并表现出与肿瘤细胞相同的生物学特性[5-7]。目前为止，循环DNA来源机制仍不十分清楚。
我们采用Picogreen 荧光染色法[8]对循环 DNA 定量检测。结果显示患者中枢浸润后脑脊液循环DNA水平明显升高。既往研究表明多种实体肿瘤患者循环DNA 水平高于健康人[5-7，9]。关于白血病患者的研究也显示循环DNA水平升高[10，11]。Leon等[12]的研究显示肿瘤负荷高的患者循环DNA水平更高。恶性血液病循环 DNA 水平高于实体肿瘤，可能与体液中肿瘤细胞多有关，提示循环肿瘤细胞与循环 DNA 有一定的相关性，而循环肿瘤细胞与肿瘤转移相关[13，14]。国内恶性血液病循环 DNA研究较少，孙开胜[15]等采用 SYBR green 荧光染色法对急性白血病患者血循环 DNA 定量分析，发现发病后循环DNA升高。本研究比较急性白血病患者中枢浸润前后脑脊液循环 DNA 水平，发现两者之间有显著差异，结合急性白血病特点分析，导致本结果的可能有以下原因：急性白血病细胞定植中枢大量增殖导致循环DNA释放；血脑屏障阻止以蛋白结合形式的循环DNA进入外周血，避免被肝脏迅速代谢[8]。
化疗后肿瘤负荷降低，肿瘤细胞来源的循环 DNA随之减少，循环 DNA 水平下降[16]。我们比较中枢神经系统白血病患者化疗前、后脑脊液循环DNA 水平，发现治疗后较治疗前明显减少，治疗效果好的患者更明显，显示出其与病情变化明显相关。中枢神经系统白血病患者治疗后脑脊液循环DNA水平仍高于未合并中枢浸润患者，考虑化疗并不能完全清除肿瘤细胞，残留的白血病细胞仍能增加循环DNA的水平，这也可能与中枢神经系统白血病即使治疗后仍多见复发有关。
综上所述，定量检测中枢神经系统白血病患者诊治过程中循环DNA水平变化，中枢神经系统白血病发病后脑脊液循环DNA水平显著升高，治疗后明显下降。显示出对疾病的早期诊断及病情监测有一定的指导意义。通过对中枢神经系统白血病患者脑脊液循环DNA的检测，我们可以更早诊断及预测病情变化，具有较大的可行性。对循环DNA的研究，有可能为中枢神经系统白血病的早期诊断、病情监测提供特异性好、灵敏度高的新的预测指标。
[参考文献]
[1] Swaminathan R，Butt AN. Circulating nucleic acids in plasma and serum：recent developments[J]. Annals of the New York Academy of Sciences，2006，10（7）：1-9. [2] Gahan PB，Swaminathan R. Circulating nucleic acids in plasma and serum. Recent developments[J]. Annals of the New York Academy of Sciences，2008，11（3）：1-6.
[3] Board RE，Williams Vs Fau-Knight L，Knight L Fau-Shaw J，et al. Isolation and extraction of circulating tumor DNA from patients with small cell lung cancer[J]. Ann.N.Y.Acad.Sci，2008，11（3）：98-107.
[4] van der Vaart M，Pretorius PJ. A method for characterization of total circulating DNA[J]. Annals of the New York Academy of Sciences，2008，11（3）：92-97.
[5] Goebel G，Zitt M Fau，Muller HM，et al. Circulating nucleic acids in plasma or serum（CNAPS） as prognostic and predictive markers in patients with solid neoplasias[J]. Dis. Markers，2005，21（3）：105-120.
[6] Kandel ES. Mutations in circulating mitochondrial DNA：Cassandra of oral cancer？[J]. Oncotarget，2012，3（7）：664-665.
[7] Figg WD，2nd，Reid J. Monitor tumor burden with circulating tumor DNA[J]. Cancer biology