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摘要
对10个引起大豆根腐病的真菌分离物进行鉴定。结果表明，这些分离物形态学上与大豆拟茎点种腐病菌相似。用ITS通用引物进行PCR扩增，该菌株与拟茎点种腐病菌MP4PL11PS （GenBank登录号HQ130441.1）同源性达98%。因此，确定该菌株为大豆拟茎点种腐病菌。
关键词
根腐病；大豆拟茎点种腐病菌；大豆；苗期；鉴定
中图分类号：
S 435.2
文献标识码：A
DOI：10.3969/j.issn.05291542.2015.05.022
Abstract
The 10 fungal isolates causing soybean root rot were identified. The results showed that 10 isolates had similarity to Phomopsis longicolla in morphology. BLAST search results showed that the sequence of P.longicolla strain MP4PL11PS （GenBank accession number HQ130441.1） was homologous to the tested strain with a similarity of 98% by using universal primers （ITS） for amplification. So， the isolated strain was identified as P.longicolla.
Key words
root rot；Phomopsis longicolla；Glycine max；seedling stage；identification
大豆拟茎点种腐病菌（Phomopsis longicolla Hobbs）属间座壳目（Diaporthales）、拟茎点霉属（Phomopsis）真菌，未发现其有性世代。该菌是重要植物病原菌，可侵染大豆、三叶草、绿豆、利马豆、豌豆、花生、大蒜、洋葱、辣椒、番茄、三裂叶豚草、苍耳、地锦、皱叶酸模等[1]。大豆拟茎点种腐病菌是大豆生产上的一种重要病原菌，目前该菌在美国、阿根廷、意大利、韩国、南斯拉夫等都有报道[23]。在中国，Cui等2009年报道黑龙江省佳木斯市在大豆鼓荚期发生的茎枯病由大豆拟茎点种腐病菌引起[4]，Shan 等2012年报道了大豆拟茎点种腐病菌在南方引起大豆种子腐烂[5]，但目前尚未有报道在大豆苗期根腐病病样中分离到大豆拟茎点种腐病菌。笔者对黑龙江省不同地理区域大豆苗期根腐病菌进行研究时，发现疑似大豆拟茎点种腐病菌分离物，并对这些分离物进行了鉴定。
1材料与方法
1.1供试菌株和供试植物
供试菌株：10个疑似大豆拟茎点种腐病菌分离物从大豆苗期根腐病株样品上分离，并保存于4 ℃备用。
供试植物：致病性测定所用大豆品种为‘合丰25’。
1.2致病性测定
供试菌株在PDA平板上培养4 d，用打孔器取直径7 mm的菌碟接种到高粱粒培养基中（高粱粒开水煮20 min，然后捞到250 mL三角瓶中，每瓶125 g，然后湿热灭菌121 ℃ 20 min），每个三角瓶中接种5个菌碟，26 ℃培养箱中黑暗培养，期间每天振荡三角瓶1次，约5 d后，菌丝布满每个高粱粒表面即可用于接种。接种方法为：在直径8 cm培养钵中放入无菌蛭石至培养钵2/3处，之后每钵均匀接入10粒带菌高粱粒，覆上约0.5 cm无菌蛭石后播种大豆品种，每钵10粒种子，最后用2 cm的无菌干蛭石覆盖在种子表面，放入不锈钢盘中，以不接种病原菌作对照，每个处理3钵（即3次重复），试验重复2次。不锈钢盘底部浇足水后放在温室中，于25 ℃、L∥D=12 h∥12 h下培养，定期浇水保持蛭石湿润，10 d后调查结果。
病情分级参照张丽等[6]提出的标准，将根腐病严重度划分为5个级别：
0级，无病；1级，须根根尖轻微变黑，主根不变，植株生长正常；3级，须根根尖变黑，主根轻微变黑严重，植株生长正常；5级，主根变黑严重，地上部生长不良，或下胚轴腐烂，植株生长矮小；7级，根部腐烂，植株死亡。
病情指数=100×∑（各级病株数×各级代表值）/（调查总株数×最高级代表值）。
获得发病植株后取病组织再一次进行分离和纯化，得到的分离物与第一次获得的分离物进行形态学比对，确定其是否为该病害的病原菌。
1.3病原菌形态特征观察
分离物在PDA平板上26 ℃黑暗下培养5 d后观察其菌落形态。取田间成株的大豆茎秆，截取5 cm小段，用70%乙醇表面消毒后，无菌水冲洗干净，放入具有4层灭菌纱布的无菌培养皿中，每段茎秆接带培养基的菌丝块1块，保湿培养，每皿3段，26 ℃、L∥D=12 h∥12 h条件下培养， 40 d后观察分离物的子座、分生孢子器和分生孢子等。
将分离物菌落及孢子等的形态特征与引起大豆病害的不同真菌种类特征进行对比[79]。确定病原菌种类。
1.4病原菌rDNAITS序列分析
在形态学鉴定的基础上，将分离物在PDA培养基上26 ℃培养7 d，刮取菌丝，采用CTAB法提取DNA[10]，并采用通用引物ITS1（5′TCCGTAGGTGAACCTTGCGG3′）和ITS4（5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′）进行分子鉴定。扩增产物经1%的琼脂糖凝胶检测后送上海生工测序，将测序结果与GenBank中的ITS序列进行同源性比较。 2结果与分析
2.1致病性测定
利用大豆品种‘合丰25’进行分离物致病力的测定，10个分离物都能够引起大豆苗期根腐病（表1），而且各菌株均表现出强致病力，发病率均在85%以上，病情指数为63.64～100.00，不同菌株致病力差异比较明显，主根基本不变色或轻微变褐，须根不长且生长点变褐，植株生长正常；或主根严重变黑，较短，须根明显减少或没有，植株生长矮小，可能与其病原菌侵染的严重程度有关，总体说来，症状特点为：植株矮小，须根不长，主根较短（图1）。通过对发病植株的组织进行分离培养，得到形态相同的真菌。
2.2形态学鉴定
在PDA培养基上26 ℃黑暗培养5 d，10个分离物菌落均棉絮状，白色，菌丝密集，呈卷毛状；培养基背面最初无色，随后可见较大的、扩展的黑色子座（图2）。在接种的大豆茎秆上产生的分生孢子器黑色，子座状，单生或聚生，单室或多室，具显著的喙。α型分生孢子大小约（5.8～7.8）μm×（1.4～2.1）μm，无色，纺锤形，单胞，有水滴状斑点；β型分生孢子较少。这些分离物的培养及形态特征描述与大豆拟茎点种腐病菌（P.longicolla）相似。
2.3ITS序列分析
由于10株真菌分离物形态学上完全一致，因此选择其中1个分离物用通用引物ITS1和ITS4对DNA进行扩增，得到的片段大小为549 bp，将该分离物ITS序列与GenBank中大豆拟茎点种腐病菌（Phomopsis longicolla）进行同源性比较，与菌株MP4PL11PS （GenBank登录号HQ130441.1）同源性达98%。结合形态学和分子生物学鉴定的结果分析，该菌株为大豆拟茎点种腐病菌，能引起大豆苗期根腐病。
3结论与讨论
引起大豆根腐病的病原菌种类多，目前在中国已经发现并报道的有尖镰孢（Fusarium oxysporum）、腐皮镰孢（F.solani）、木贼镰孢（F.equiseti）、禾谷镰孢（F.graminearum）、燕麦镰孢（F.avenaceum）、半裸镰孢（F.semitactum）、轮枝镰孢（F.verticillioides）、蓝色镰孢（F.coeruleum）、厚垣镰孢（F.chlamydosporum）、层出镰孢（F.proliferatum）、 三隔镰孢（F.tricinctum）、壳生镰孢（F.episphaeria）、节状镰孢（F.merismoidescorda）、立枯丝核菌（Rhizoctoia solani）、大豆疫霉（Phytophthora sojae）、终极腐霉 （Pythium ultimum）、瓜果腐霉（P.aphanidermatum）[79，1114 ]。虽然我国大豆根腐病菌种类丰富，但目前的报道认为危害较大的为尖镰孢和腐皮镰孢，其他病原菌危害面积及程度远不及这两种菌。本研究在黑龙江省不同地理区域进行大豆根腐病病原菌采集、分离和鉴定，发现在中国大豆苗期根腐病中未报道过的一种真菌病原物。通过形态学和分子鉴定，确定其是大豆拟茎点种腐病菌（P.longicolla），其所占分离物的比例为3.16%。
迄今，我国除海关在口岸查获国外大豆携带大豆拟茎点种腐病菌（P.longicolla）外，该菌只有在大豆茎枯病和大豆种腐病中报道过3次[45， 15]，在广东茄子茎溃疡病中报道过1次[16]。在国内尚未报道从大豆苗期根腐病病样中分离到大豆拟茎点种腐病菌（P.longicolla）。本研究在黑龙江省多地发现该病原菌引起大豆苗期根腐病。由于大豆拟茎点种腐病菌（P.longicolla）对大豆具有极强的致病力，对大豆生产的危害巨大，建议在我国开展该病的普查、药剂筛选和抗源测定等工作，以防止该病原菌对我国大豆生产的潜在危害及在我国大豆产区蔓延。
参考文献
[1]Roy K W， Ratnmayake S， McLean K.Colonization of weeds by Phomopsis longicolla [J]. Canadian Journal of Plant Pathology， 1997，19（2）：193196.
[2]李雪光，李淑娴，宋洁，等.大豆拟茎点种腐病菌（Phomopsis longicolla）对大豆种子致病性及侵入部位研究[J].大豆科学，2014，33（3）：455457.
[3]Zhang A W， Riccioni L， Pedersen W L， et al. Molecular identification and phylogenetic grouping of Diaporthe phaseolorum and Phomopsis longicolla isolates from soybean [J]. Phytopathology， 1998， 88 （12）： 13061314.
[4]Cui Y L， Duan C X， Wang X M， et al. First report of Phomopsis longicolla causing soybean stem blight in China [J]. Plant Pathology， 2009， 58 （4）：799.
[5]Shan Z， Li S， Liu Y， et al. First report of Phomopsis seed decay of soybean caused by Phomopsis longicolla in South China [J]. Plant Disease， 2012， 96（1）： 1693.
[6]张丽， 耿肖兵， 王春玲， 等. 黑龙江省大豆镰孢根腐病菌鉴定及致病力分析[J]. 植物保护， 2014， 40（3）： 165168. [7]白丽艳，张全党，李斌，等.新疆阿勒泰地区大豆镰刀菌根腐病病原鉴定及致病性测定[J].新疆农业科学，2009，46（3）：543548.
[8]崔友林，段灿星，丁俊杰，等.一种新发生的大豆茎枯病病原菌鉴定[J].中国油料作物学报，2010，32（1）：99103.
[9]王晓艳，文景芝. 东北三省大豆根腐镰孢菌种类及其致病力分析[J]. 中国油料作物学报， 2011， 33（4）： 391395.
[10]Kuhad R C， Kapoor R K， Lal R. Improving the yield and quality of DNA isolated from whiterot fungi [J]. Folia Microbiologica， 2004， 49（2）： 112116.
[11]梁喜龙， 郑殿峰， 左豫虎. 大豆根腐病的研究现状及展望[J]. 黑龙江八一农垦大学学报， 2003， 15（4）： 3034.
[12]李本金， 陈庆河， 兰成忠， 等. 福建省大豆根腐病病原菌的鉴定[J]. 福建农业学报， 2011， 26（5）： 798803.
[13]杨帅， 王健生， 马振川， 等. 引致大豆根腐病的层出镰孢菌分离鉴定及其特性[J]. 植物保护学报， 2012， 39（2）： 187188.
[14]马淑梅. 黑龙江省大豆根腐病致病病原种类分布及抗病种质鉴定[J]. 中国农学通报， 2012， 28（27）： 230235.
[15]Chen X， Pan R， Xu D， et al. First report of soybean stem blight caused by Phomopsis longicolla in Guangdong Province， southern China [J]. Plant Disease， 2013， 97（6）：844.
[16]Shu C， Chen J， Huang H， et al. First report of Phomopsis longicolla causing stem canker of eggplant in Guangdong， China [J]. Plant Disease， 2014， 98（3）： 426.
（责任编辑：杨明丽）
对10个引起大豆根腐病的真菌分离物进行鉴定。结果表明，这些分离物形态学上与大豆拟茎点种腐病菌相似。用ITS通用引物进行PCR扩增，该菌株与拟茎点种腐病菌MP4PL11PS （GenBank登录号HQ130441.1）同源性达98%。因此，确定该菌株为大豆拟茎点种腐病菌。
关键词
根腐病；大豆拟茎点种腐病菌；大豆；苗期；鉴定
中图分类号：
S 435.2
文献标识码：A
DOI：10.3969/j.issn.05291542.2015.05.022
Abstract
The 10 fungal isolates causing soybean root rot were identified. The results showed that 10 isolates had similarity to Phomopsis longicolla in morphology. BLAST search results showed that the sequence of P.longicolla strain MP4PL11PS （GenBank accession number HQ130441.1） was homologous to the tested strain with a similarity of 98% by using universal primers （ITS） for amplification. So， the isolated strain was identified as P.longicolla.
Key words
root rot；Phomopsis longicolla；Glycine max；seedling stage；identification
大豆拟茎点种腐病菌（Phomopsis longicolla Hobbs）属间座壳目（Diaporthales）、拟茎点霉属（Phomopsis）真菌，未发现其有性世代。该菌是重要植物病原菌，可侵染大豆、三叶草、绿豆、利马豆、豌豆、花生、大蒜、洋葱、辣椒、番茄、三裂叶豚草、苍耳、地锦、皱叶酸模等[1]。大豆拟茎点种腐病菌是大豆生产上的一种重要病原菌，目前该菌在美国、阿根廷、意大利、韩国、南斯拉夫等都有报道[23]。在中国，Cui等2009年报道黑龙江省佳木斯市在大豆鼓荚期发生的茎枯病由大豆拟茎点种腐病菌引起[4]，Shan 等2012年报道了大豆拟茎点种腐病菌在南方引起大豆种子腐烂[5]，但目前尚未有报道在大豆苗期根腐病病样中分离到大豆拟茎点种腐病菌。笔者对黑龙江省不同地理区域大豆苗期根腐病菌进行研究时，发现疑似大豆拟茎点种腐病菌分离物，并对这些分离物进行了鉴定。
1材料与方法
1.1供试菌株和供试植物
供试菌株：10个疑似大豆拟茎点种腐病菌分离物从大豆苗期根腐病株样品上分离，并保存于4 ℃备用。
供试植物：致病性测定所用大豆品种为‘合丰25’。
1.2致病性测定
供试菌株在PDA平板上培养4 d，用打孔器取直径7 mm的菌碟接种到高粱粒培养基中（高粱粒开水煮20 min，然后捞到250 mL三角瓶中，每瓶125 g，然后湿热灭菌121 ℃ 20 min），每个三角瓶中接种5个菌碟，26 ℃培养箱中黑暗培养，期间每天振荡三角瓶1次，约5 d后，菌丝布满每个高粱粒表面即可用于接种。接种方法为：在直径8 cm培养钵中放入无菌蛭石至培养钵2/3处，之后每钵均匀接入10粒带菌高粱粒，覆上约0.5 cm无菌蛭石后播种大豆品种，每钵10粒种子，最后用2 cm的无菌干蛭石覆盖在种子表面，放入不锈钢盘中，以不接种病原菌作对照，每个处理3钵（即3次重复），试验重复2次。不锈钢盘底部浇足水后放在温室中，于25 ℃、L∥D=12 h∥12 h下培养，定期浇水保持蛭石湿润，10 d后调查结果。
病情分级参照张丽等[6]提出的标准，将根腐病严重度划分为5个级别：
0级，无病；1级，须根根尖轻微变黑，主根不变，植株生长正常；3级，须根根尖变黑，主根轻微变黑严重，植株生长正常；5级，主根变黑严重，地上部生长不良，或下胚轴腐烂，植株生长矮小；7级，根部腐烂，植株死亡。
病情指数=100×∑（各级病株数×各级代表值）/（调查总株数×最高级代表值）。
获得发病植株后取病组织再一次进行分离和纯化，得到的分离物与第一次获得的分离物进行形态学比对，确定其是否为该病害的病原菌。
1.3病原菌形态特征观察
分离物在PDA平板上26 ℃黑暗下培养5 d后观察其菌落形态。取田间成株的大豆茎秆，截取5 cm小段，用70%乙醇表面消毒后，无菌水冲洗干净，放入具有4层灭菌纱布的无菌培养皿中，每段茎秆接带培养基的菌丝块1块，保湿培养，每皿3段，26 ℃、L∥D=12 h∥12 h条件下培养， 40 d后观察分离物的子座、分生孢子器和分生孢子等。
将分离物菌落及孢子等的形态特征与引起大豆病害的不同真菌种类特征进行对比[79]。确定病原菌种类。
1.4病原菌rDNAITS序列分析
在形态学鉴定的基础上，将分离物在PDA培养基上26 ℃培养7 d，刮取菌丝，采用CTAB法提取DNA[10]，并采用通用引物ITS1（5′TCCGTAGGTGAACCTTGCGG3′）和ITS4（5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′）进行分子鉴定。扩增产物经1%的琼脂糖凝胶检测后送上海生工测序，将测序结果与GenBank中的ITS序列进行同源性比较。 2结果与分析
2.1致病性测定
利用大豆品种‘合丰25’进行分离物致病力的测定，10个分离物都能够引起大豆苗期根腐病（表1），而且各菌株均表现出强致病力，发病率均在85%以上，病情指数为63.64～100.00，不同菌株致病力差异比较明显，主根基本不变色或轻微变褐，须根不长且生长点变褐，植株生长正常；或主根严重变黑，较短，须根明显减少或没有，植株生长矮小，可能与其病原菌侵染的严重程度有关，总体说来，症状特点为：植株矮小，须根不长，主根较短（图1）。通过对发病植株的组织进行分离培养，得到形态相同的真菌。
2.2形态学鉴定
在PDA培养基上26 ℃黑暗培养5 d，10个分离物菌落均棉絮状，白色，菌丝密集，呈卷毛状；培养基背面最初无色，随后可见较大的、扩展的黑色子座（图2）。在接种的大豆茎秆上产生的分生孢子器黑色，子座状，单生或聚生，单室或多室，具显著的喙。α型分生孢子大小约（5.8～7.8）μm×（1.4～2.1）μm，无色，纺锤形，单胞，有水滴状斑点；β型分生孢子较少。这些分离物的培养及形态特征描述与大豆拟茎点种腐病菌（P.longicolla）相似。
2.3ITS序列分析
由于10株真菌分离物形态学上完全一致，因此选择其中1个分离物用通用引物ITS1和ITS4对DNA进行扩增，得到的片段大小为549 bp，将该分离物ITS序列与GenBank中大豆拟茎点种腐病菌（Phomopsis longicolla）进行同源性比较，与菌株MP4PL11PS （GenBank登录号HQ130441.1）同源性达98%。结合形态学和分子生物学鉴定的结果分析，该菌株为大豆拟茎点种腐病菌，能引起大豆苗期根腐病。
3结论与讨论
引起大豆根腐病的病原菌种类多，目前在中国已经发现并报道的有尖镰孢（Fusarium oxysporum）、腐皮镰孢（F.solani）、木贼镰孢（F.equiseti）、禾谷镰孢（F.graminearum）、燕麦镰孢（F.avenaceum）、半裸镰孢（F.semitactum）、轮枝镰孢（F.verticillioides）、蓝色镰孢（F.coeruleum）、厚垣镰孢（F.chlamydosporum）、层出镰孢（F.proliferatum）、 三隔镰孢（F.tricinctum）、壳生镰孢（F.episphaeria）、节状镰孢（F.merismoidescorda）、立枯丝核菌（Rhizoctoia solani）、大豆疫霉（Phytophthora sojae）、终极腐霉 （Pythium ultimum）、瓜果腐霉（P.aphanidermatum）[79，1114 ]。虽然我国大豆根腐病菌种类丰富，但目前的报道认为危害较大的为尖镰孢和腐皮镰孢，其他病原菌危害面积及程度远不及这两种菌。本研究在黑龙江省不同地理区域进行大豆根腐病病原菌采集、分离和鉴定，发现在中国大豆苗期根腐病中未报道过的一种真菌病原物。通过形态学和分子鉴定，确定其是大豆拟茎点种腐病菌（P.longicolla），其所占分离物的比例为3.16%。
迄今，我国除海关在口岸查获国外大豆携带大豆拟茎点种腐病菌（P.longicolla）外，该菌只有在大豆茎枯病和大豆种腐病中报道过3次[45， 15]，在广东茄子茎溃疡病中报道过1次[16]。在国内尚未报道从大豆苗期根腐病病样中分离到大豆拟茎点种腐病菌（P.longicolla）。本研究在黑龙江省多地发现该病原菌引起大豆苗期根腐病。由于大豆拟茎点种腐病菌（P.longicolla）对大豆具有极强的致病力，对大豆生产的危害巨大，建议在我国开展该病的普查、药剂筛选和抗源测定等工作，以防止该病原菌对我国大豆生产的潜在危害及在我国大豆产区蔓延。
参考文献
[1]Roy K W， Ratnmayake S， McLean K.Colonization of weeds by Phomopsis longicolla [J]. Canadian Journal of Plant Pathology， 1997，19（2）：193196.
[2]李雪光，李淑娴，宋洁，等.大豆拟茎点种腐病菌（Phomopsis longicolla）对大豆种子致病性及侵入部位研究[J].大豆科学，2014，33（3）：455457.
[3]Zhang A W， Riccioni L， Pedersen W L， et al. Molecular identification and phylogenetic grouping of Diaporthe phaseolorum and Phomopsis longicolla isolates from soybean [J]. Phytopathology， 1998， 88 （12）： 13061314.
[4]Cui Y L， Duan C X， Wang X M， et al. First report of Phomopsis longicolla causing soybean stem blight in China [J]. Plant Pathology， 2009， 58 （4）：799.
[5]Shan Z， Li S， Liu Y， et al. First report of Phomopsis seed decay of soybean caused by Phomopsis longicolla in South China [J]. Plant Disease， 2012， 96（1）： 1693.
[6]张丽， 耿肖兵， 王春玲， 等. 黑龙江省大豆镰孢根腐病菌鉴定及致病力分析[J]. 植物保护， 2014， 40（3）： 165168. [7]白丽艳，张全党，李斌，等.新疆阿勒泰地区大豆镰刀菌根腐病病原鉴定及致病性测定[J].新疆农业科学，2009，46（3）：543548.
[8]崔友林，段灿星，丁俊杰，等.一种新发生的大豆茎枯病病原菌鉴定[J].中国油料作物学报，2010，32（1）：99103.
[9]王晓艳，文景芝. 东北三省大豆根腐镰孢菌种类及其致病力分析[J]. 中国油料作物学报， 2011， 33（4）： 391395.
[10]Kuhad R C， Kapoor R K， Lal R. Improving the yield and quality of DNA isolated from whiterot fungi [J]. Folia Microbiologica， 2004， 49（2）： 112116.
[11]梁喜龙， 郑殿峰， 左豫虎. 大豆根腐病的研究现状及展望[J]. 黑龙江八一农垦大学学报， 2003， 15（4）： 3034.
[12]李本金， 陈庆河， 兰成忠， 等. 福建省大豆根腐病病原菌的鉴定[J]. 福建农业学报， 2011， 26（5）： 798803.
[13]杨帅， 王健生， 马振川， 等. 引致大豆根腐病的层出镰孢菌分离鉴定及其特性[J]. 植物保护学报， 2012， 39（2）： 187188.
[14]马淑梅. 黑龙江省大豆根腐病致病病原种类分布及抗病种质鉴定[J]. 中国农学通报， 2012， 28（27）： 230235.
[15]Chen X， Pan R， Xu D， et al. First report of soybean stem blight caused by Phomopsis longicolla in Guangdong Province， southern China [J]. Plant Disease， 2013， 97（6）：844.
[16]Shu C， Chen J， Huang H， et al. First report of Phomopsis longicolla causing stem canker of eggplant in Guangdong， China [J]. Plant Disease， 2014， 98（3）： 426.
（责任编辑：杨明丽）