【摘 要】
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目的 探讨组蛋白去乙酰化酶6 (HDAC6)在嗜肺军团菌干扰巨噬细胞自噬中的作用及机制.方法 采用(10、5、2.5)μnol/L tubastatin A(TubA)处理RAW264.7巨噬细胞,CCK-8法检测RAW2
【机 构】
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宁夏医科大学基础医学院病原生物学与免疫学系,宁夏银川750004;宁夏医科大学生育力保持省部级共建教育部重点实验室,宁夏银川750004
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目的 探讨组蛋白去乙酰化酶6 (HDAC6)在嗜肺军团菌干扰巨噬细胞自噬中的作用及机制.方法 采用(10、5、2.5)μnol/L tubastatin A(TubA)处理RAW264.7巨噬细胞,CCK-8法检测RAW264.7巨噬细胞的增殖活性确定TubA的半数抑制浓度(IC.).建立嗜肺军团菌感染RAW264.7巨噬细胞感染模型,实验分为无TubA组(每组设细胞对照组、灭活菌组、活菌组),(10、5、2.5) μmol/L TubA处理组(每组均设细胞对照组、灭活菌组、活菌组).嗜肺军团菌感染6、12、24、48h,收集各组细胞.细菌增殖实验检测嗜肺军团菌在RAW264.7巨噬细胞内增殖的情况;pmCherry-C1-EGFP-LC3B质粒转染RAW264.7小鼠巨噬细胞检测各组内自噬流变化;实时定量PCR和Western blot法检测组蛋白去乙酰化酶6(HDAC6)、P62、微管相关蛋白1轻链3(LC3)、α微管蛋白(α-tubulin)、含缬酪肽蛋白(p97/VCP)、热休克蛋白90(HSP90)、HSP7O、热休克转录因子1(HSF1)和纤维型肌动蛋白(F-actin)的mRNA及蛋白表达水平.结果 TubA的IC50为50μmol/L.与RAW264.7细胞正常对照组相比,加入TubA后,嗜肺军团菌在小鼠巨噬细胞内增殖明显减少.在无HDAC6抑制剂组中,与正常对照组相比,活菌组比灭活菌组对自噬流的抑制作用更强.在HDAC6抑制剂TubA组中,活菌组的绿色荧光亮点均减少,自噬流增加.嗜肺军团菌的灭活菌和活菌分别作用于RAW264.7巨噬细胞6、12、24、48h,与正常对照RAW264.7细胞相比,TubA嗜肺军团菌干扰组HDAC6、α-tubulin、p97/VCP、P62 mRNA和蛋白表达均降低.结论 嗜肺军团菌干扰RAW264.7巨噬细胞自噬与HDAC6/P62/LC3B和HDAC6/p97/HSF1信号通路有关.
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