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摘要 [目的] 建立水产品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫、亮绿的快速检测方法。[方法] 采用氯化钠溶液与二氯甲烷液液萃取净化，建立快速检测水产品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫、亮绿的超高液相色谱-串联质谱方法。[結果]孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫、亮绿5种化合物的标准曲线相关系数均大于0.992，信噪比均在10以上，加标回收率为80.40%～119.70%，相对标准偏差为3.4%～6.2%，说明该检测方法具有良好的准确度和精密度。[结论] 建立的UPLCMSMS方法适用于水产品中亮绿、孔雀石绿、结晶紫及其代谢物的检测。
关键词 亮绿；孔雀石绿；结晶紫；隐色孔雀石绿；隐色结晶紫；超高效液相色谱-串联质谱
中图分类号 S912 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）35-164-03
Abstract [Objective] The aim was to establish rapid detection method of malachite green， leucomalachite green， crystal violet， leucocrystal violet and bright green in aquatic products. [Method] The compounds were extracted and purified with sodium chloride solution and dichloromethane to establish UPLCMSMS for rapidly detecting malachite green ， leucomalachite green， crystal violet， leucocrystal violet and bright green in aquatic products. [Result] The correlation coefficients of the standard curve of five kinds of compounds（malachite green， leucomalachite green， crystal violet， leucocrystal violet and bright green ） were all more than 0.992， the signalnoise ratio was all more than 10， and the addition recovery was 80.40%-119.7% with RSD of 3.4%-6.2%， which indicated that the detection method had good accuracy and precision. [Conclusion] The established UPLCMSMS is suitable for detecting malachite green， leucomalachite green， crystal violet， leucocrystal violet and bright green in aquatic products.
Key words Bright green；Malachite green；Crystal violet；Leucomalachite green；Leucocrystal violet；UPLC MSMS
孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫、亮绿都属于碱性三苯甲烷类染料，具有类似的结构（图1），在水产养殖过程中常用作杀菌剂和抗寄生虫药，用于防治各种鱼病[1-3]。由于三苯甲烷具有致突变、致畸和致癌作用，欧美、我国和日本等已经严禁在水产养殖中使用孔雀石绿和结晶紫，并规定孔雀石绿（含隐色孔雀石绿）和结晶紫（含隐色结晶紫）不得检出[4-6]。孔雀石绿因其效果明显、价格低廉而被大量应用于鳗鱼、鲤鱼、鲫鱼及其他水产苗种中，主要用于防治水霉病。但是，兽药残留作为水产品安全的首要问题直接影响到我国水产品质量安全及其出口创汇[7-9]。目前，在生产中使用孔雀石绿的不多，主要集中在水产品流通环节。因此，对于水产品中孔雀石绿残留量的持续检测和监控十分重要。
目前，水产品中孔雀石绿的检测方法有高效液相色谱法和液质联用法[10-15]，但液相色谱法有其缺陷性，主要表现为方法的检出限已达不到越来越严格的市场要求，目前通常采用乙腈提取亮绿、孔雀石绿与结晶紫，采用正己烷进行去脂净化[16-20]，但正己烷会造成目标物损失，特别是隐色结晶紫和隐色孔雀石绿损失。为了降低目标物的损失率，笔者采用氯化钠溶液与二氯甲烷液液萃取净化，在保证高回收率的同时降低了样品的基质干扰，提高了灵敏度，适用于水产品中亮绿、孔雀石绿、结晶紫及其代谢物的检测。
1.1.1 仪器。UPLCQuattro Premier XE超高效液相色谱-串联质谱仪（Waters公司）；食品加工机（飞利浦）；高速离心机TDL5A（上海飞鸽）；旋涡混合器XW80A（上海青浦沪西）；旋转蒸发仪NA1001WA（日本东京EYELA）；中性氧化铝小柱（LCAluminaN）。
1.1.2 试剂及其配制。孔雀石绿、结晶紫、隐色孔雀石绿、隠色结晶紫、亮绿，均购自德国Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈、二氯甲烷、异丙醇、乙酸铵、甲酸、冰乙酸均为色谱纯，购自天津科密欧公司；氯化钠、硫酸钠，均为分析纯，购自天津科密欧公司；超纯水，使用Millipore超纯水器自制。取0.5 ml甲酸加入到500 ml的乙腈中，摇匀。称取0.19 g乙酸铵溶于500 ml水，然后向其中加入0.5 ml甲酸，摇匀。按照乙腈：5 mmol/L乙酸铵（用冰乙酸调节pH至4.5）=8∶2进行定容。 1.2 标准储备液和标准工作液的配制
1.2.1 标准储备液的配制。分别称取10.000 0 mg（精确至0.000 1 mg）的MG、LMG、CV、LCV、BG 5种标准品，用乙腈溶解并定容至100 ml，制成浓度为100 μg/ml的标准储备液，0～4 ℃条件下避光保存。
1.2.2 混合标准储备液的配制。各取MG、LMG、CV、LCV、BG储备液10 ml，用乙腈稀释定容至100 ml，制成浓度为10 μg/ml的混合标准储备液，0～4 ℃避光保存。
1.2.3 混合标准中间液及工作液的配制。移取10 ml混合标准储备液，用乙腈稀释定容至100 ml，制成1 μg/ml的混合标准中间液，标准品工作液按照需要逐级稀释，低浓度标准品工作液临用时使用定容溶剂稀释配制。
1.3 液相色谱分析条件 色谱柱：BEH C18柱（2.1 mm×50 mm），粒径1.7 μm；柱温：35 ℃；样品室温度：20 ℃；进样体积：5 μl；流动相：A缓冲盐溶液（5 mmol/L乙酸铵水溶液、0.1%的甲酸）、B乙腈（0.1%的甲酸）；流速为0.25 ml/min 梯度洗脱，具体梯度洗脱条件见表1。
1.4 质谱分析条件 电喷雾离子源：正离子电离（ESI+）；毛细管电压：3.0 kV；离子源温度：100 ℃；二级锥孔电压：3 V；锥孔反吹气：50 L/h；去溶剂气温度：350 ℃；去溶剂气流量：700 L/h；低质量分辨率LM1 13.0，高质量分辨率HM1 13.0，离子能量1为0.5 V，碰撞室入口电压为0 V，碰撞室出口电压为0 V，碰撞气流量为0.2 ml/min，碰撞室压力为3.0×10-3 Pa，低质量分辨率LM2为13.0，高质量分辨率HM2为13.0，离子能量2为1.0 V，光电倍增管电压为650 V。在质谱分析过程中，以保留时间和离子对信息比较进行定性分析，以母离子和响应值高的子离子进行定量。孔雀石绿等5种化合物在MRM模式下的质谱参数如表2所示。
1.5 方法
1.5.1 取样。取水产品可食用部分充分绞碎混匀后，称取5.00 g（精确至0.01 g）置于50 ml离心管中。
1.5.2 提取。向离心管中加入15 ml乙腈，充分振荡提取，旋涡混合3 min，5 000 r/min离心分离，重复提取1次，合并2次上清液，并转入250 ml分液漏斗中。
1.5.3 轉容净化。向分液漏斗中加入20 ml 10%氯化钠水溶液，20 ml二氯甲烷，振荡3 min（注意放气），静置分层后，去除下层水相；上层乙腈和二氯甲烷层过预先用乙腈淋洗的无水硫酸钠脱水净化，并收集到茄形瓶中，然后用20 ml乙腈分数次洗涤硫酸钠，滤液一并转入茄形瓶中。
1.5.4 浓缩溶解。加入10 ml异丙醇，40 ℃以下浓缩至干，用2 ml定容溶液溶解残渣。
1.5.5 再净化。残渣溶解液过中性氧化铝，前面3～5滴流出液弃去，全部收集随后的流出液并过0.2 μm滤膜。
2 结果与分析
2.1 标准曲线的相关系数 将浓度分别为0.5、1.0、2.0、50、10 μg/L的混合标准系列，依次进样，进样量均为5 μl，化合物MG、LMG、CV、LCV和BG的标准曲线相关系数分别为0.998 026、0.994 963、0.995 248、0.992 089和0.995 606。
2.2 检测限 进样0.5 μg/L的5种化合物（MG、LMG、CV、LCV、BG）的混合标准物质，将仪器检测限定为1.0μg/L，孔雀石绿（MG）、隐色孔雀石（LMG）、结晶紫（CV）、隐色结晶紫（LCV）和亮绿（BG）在UPLC/MS/MS上的信噪比分别为1 072.37、1 177.39、138.26、39.29和210.35。
2.3 质谱分析结果 从图2可以看出，孔雀石绿、隐色孔雀石、结晶紫、隐色结晶紫和亮绿的保留时间分别为2.22、2.77、2.30、2.57和2.42 min。
2.4 添加回收试验 分别以鱿鱼和章鱼为空白样品进行基质回收试验，在0.1和0.2 μg/kg水平上进行加标回收试验。由表3可知，亮绿、孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫的平均回收率为80.40%～119.70%，相对标准偏差（RSD）为3.4%～6.2%，说明具有良好的准确度和精密度。
3 小结
该试验建立的UPLSMSMS方法避免了目标物的大量损失，在优化的色谱质谱条件下对孔雀石绿（隐）、结晶紫（隐）和亮绿5种化合物实现了有效分离，并且出峰时间合适，检测灵敏度较高，精密度良好，回收率较高，方法检测定量限为5μg/kg，适用性均良好，可满足水产品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫、亮绿5种化合物的检测要求。
图2 5种化合物的质谱图 安徽农业科学 2015年参考文献
[1] 邱绪建，林洪，江洁.渔药孔雀石绿及其关联化合物检测方法研究进展[J].海洋水产研究，2005，26（2）：92-96.
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[3] PLAKAS S M，ElSAID K R，STEHLY G R，et al.Optimization of aliquid chromatographic method for determination of malachite green and its metabolites in fish tissues[J].JAOAC，1995，78（6）：1388-1394.
[4] 王丽敏，杜雪莉，赵艳，等.超高效液相色谱-串联质谱快速测定水产品中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物残留量[J].南方水产，2010，4（6）：32-36. [5] 桂英爱，张秀研，玛琳，等. 用紫外和荧光检测器同时分析水产品中孔雀石绿和无色孔雀石绿含量的高效液相色谱法[J]. 水产科学，2008（2）：82-85.
[6] HAJEE C A J，HAAGSMA N J.Simultaneous determination of malachite green and its metabolite leucomalachite green in eel plasma using postcolumn oxidation [J].J Chromatogr B，1995，699（2）：82-85.
[7] 谭建林，苏钟，璧韩熠，等.高效液相色谱法同时测定食品包装材料中9 种禁用染料的含量[J].安徽农业科学，2012，40（16）：8954-8955，8966.
[8] 任秀莲，魏琦峰.曲径，等.反相高效液相色谱法测定水产品中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物[J].化学分析计量，2006，15（4）：32-34.
[9] 张志刚，施冰，陈鹭平，等. 液相色谱法同时测定水产品中孔雀石绿和结晶紫残留[J]. 分析化学研究简报，2006，34（ 5）：663-667.
[10] 郭德华，叶长淋，朱莹洁.液相色谱法测定鳗鱼中的孔雀石綠[J].化学分析计量，2002，11（2）：20-21.
[11] 唐宁，周梅仙，杨平.HPCE 测定鱼体内孔雀石绿主要代谢物的残留[J].安徽农业科学，2008，36（27）：11635-11636.
[12] 龚朋飞，王权，陈永军.孔雀石绿毒性及其检测研究进展[J].水利渔业，2007，27（4）：1-4.
[13] 高华鹏，李永夫，刘海山，等.孔雀石绿等染料物质残留检测过程中实验室污染的来源分析[J].中国兽药杂志，2008，42（8）：21-25.
[14] 朱宽正，王鹏，林雁飞，等.液相色谱-串联质谱法同时测定水产品中孔雀石绿、结晶紫及其他们的隐色代谢物残留[J].色谱，2007，25（1）：66-69.
[15] 苏建峰，连文浩，陈文凯.超高效液相色谱-串联质谱快速检测水产品中孔雀石绿及无色孔雀石绿[J].理化检验（化学分册），2007，43（11）：937-939，942.
[16] 刘海新，张农，钱卓真.水产品中孔雀石绿检测方法研究进展[J].福建水产，2007（1）：41-45.
[17] 郭徳华，叶长淋，李波.高效液相色谱-质谱法测定水产品中孔雀石绿及代谢物[J].分析测试学报，2004，13（5）：206-208.
[18] 朱宽正，王鹏，林雁飞.液相色谱—串联质谱法同时测定水产品中孔雀石绿、结晶紫及它们的隐色代谢物残留[J].色谱，2007，25（1）：66-69.
[19] 全国水产标准化技术委员会.水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定：高效液相色谱荧光检测法：GB/T 20361-2006[S].北京：中国标准出版社，2006.
[20] 中华人民共和国农业部.水产品中孔雀石绿残留量的测定：液相色谱法：SC 3021-2004[S].北京：农业部，2004.
关键词 亮绿；孔雀石绿；结晶紫；隐色孔雀石绿；隐色结晶紫；超高效液相色谱-串联质谱
中图分类号 S912 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）35-164-03
Abstract [Objective] The aim was to establish rapid detection method of malachite green， leucomalachite green， crystal violet， leucocrystal violet and bright green in aquatic products. [Method] The compounds were extracted and purified with sodium chloride solution and dichloromethane to establish UPLCMSMS for rapidly detecting malachite green ， leucomalachite green， crystal violet， leucocrystal violet and bright green in aquatic products. [Result] The correlation coefficients of the standard curve of five kinds of compounds（malachite green， leucomalachite green， crystal violet， leucocrystal violet and bright green ） were all more than 0.992， the signalnoise ratio was all more than 10， and the addition recovery was 80.40%-119.7% with RSD of 3.4%-6.2%， which indicated that the detection method had good accuracy and precision. [Conclusion] The established UPLCMSMS is suitable for detecting malachite green， leucomalachite green， crystal violet， leucocrystal violet and bright green in aquatic products.
Key words Bright green；Malachite green；Crystal violet；Leucomalachite green；Leucocrystal violet；UPLC MSMS
孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫、亮绿都属于碱性三苯甲烷类染料，具有类似的结构（图1），在水产养殖过程中常用作杀菌剂和抗寄生虫药，用于防治各种鱼病[1-3]。由于三苯甲烷具有致突变、致畸和致癌作用，欧美、我国和日本等已经严禁在水产养殖中使用孔雀石绿和结晶紫，并规定孔雀石绿（含隐色孔雀石绿）和结晶紫（含隐色结晶紫）不得检出[4-6]。孔雀石绿因其效果明显、价格低廉而被大量应用于鳗鱼、鲤鱼、鲫鱼及其他水产苗种中，主要用于防治水霉病。但是，兽药残留作为水产品安全的首要问题直接影响到我国水产品质量安全及其出口创汇[7-9]。目前，在生产中使用孔雀石绿的不多，主要集中在水产品流通环节。因此，对于水产品中孔雀石绿残留量的持续检测和监控十分重要。
目前，水产品中孔雀石绿的检测方法有高效液相色谱法和液质联用法[10-15]，但液相色谱法有其缺陷性，主要表现为方法的检出限已达不到越来越严格的市场要求，目前通常采用乙腈提取亮绿、孔雀石绿与结晶紫，采用正己烷进行去脂净化[16-20]，但正己烷会造成目标物损失，特别是隐色结晶紫和隐色孔雀石绿损失。为了降低目标物的损失率，笔者采用氯化钠溶液与二氯甲烷液液萃取净化，在保证高回收率的同时降低了样品的基质干扰，提高了灵敏度，适用于水产品中亮绿、孔雀石绿、结晶紫及其代谢物的检测。
1.1.1 仪器。UPLCQuattro Premier XE超高效液相色谱-串联质谱仪（Waters公司）；食品加工机（飞利浦）；高速离心机TDL5A（上海飞鸽）；旋涡混合器XW80A（上海青浦沪西）；旋转蒸发仪NA1001WA（日本东京EYELA）；中性氧化铝小柱（LCAluminaN）。
1.1.2 试剂及其配制。孔雀石绿、结晶紫、隐色孔雀石绿、隠色结晶紫、亮绿，均购自德国Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈、二氯甲烷、异丙醇、乙酸铵、甲酸、冰乙酸均为色谱纯，购自天津科密欧公司；氯化钠、硫酸钠，均为分析纯，购自天津科密欧公司；超纯水，使用Millipore超纯水器自制。取0.5 ml甲酸加入到500 ml的乙腈中，摇匀。称取0.19 g乙酸铵溶于500 ml水，然后向其中加入0.5 ml甲酸，摇匀。按照乙腈：5 mmol/L乙酸铵（用冰乙酸调节pH至4.5）=8∶2进行定容。 1.2 标准储备液和标准工作液的配制
1.2.1 标准储备液的配制。分别称取10.000 0 mg（精确至0.000 1 mg）的MG、LMG、CV、LCV、BG 5种标准品，用乙腈溶解并定容至100 ml，制成浓度为100 μg/ml的标准储备液，0～4 ℃条件下避光保存。
1.2.2 混合标准储备液的配制。各取MG、LMG、CV、LCV、BG储备液10 ml，用乙腈稀释定容至100 ml，制成浓度为10 μg/ml的混合标准储备液，0～4 ℃避光保存。
1.2.3 混合标准中间液及工作液的配制。移取10 ml混合标准储备液，用乙腈稀释定容至100 ml，制成1 μg/ml的混合标准中间液，标准品工作液按照需要逐级稀释，低浓度标准品工作液临用时使用定容溶剂稀释配制。
1.3 液相色谱分析条件 色谱柱：BEH C18柱（2.1 mm×50 mm），粒径1.7 μm；柱温：35 ℃；样品室温度：20 ℃；进样体积：5 μl；流动相：A缓冲盐溶液（5 mmol/L乙酸铵水溶液、0.1%的甲酸）、B乙腈（0.1%的甲酸）；流速为0.25 ml/min 梯度洗脱，具体梯度洗脱条件见表1。
1.4 质谱分析条件 电喷雾离子源：正离子电离（ESI+）；毛细管电压：3.0 kV；离子源温度：100 ℃；二级锥孔电压：3 V；锥孔反吹气：50 L/h；去溶剂气温度：350 ℃；去溶剂气流量：700 L/h；低质量分辨率LM1 13.0，高质量分辨率HM1 13.0，离子能量1为0.5 V，碰撞室入口电压为0 V，碰撞室出口电压为0 V，碰撞气流量为0.2 ml/min，碰撞室压力为3.0×10-3 Pa，低质量分辨率LM2为13.0，高质量分辨率HM2为13.0，离子能量2为1.0 V，光电倍增管电压为650 V。在质谱分析过程中，以保留时间和离子对信息比较进行定性分析，以母离子和响应值高的子离子进行定量。孔雀石绿等5种化合物在MRM模式下的质谱参数如表2所示。
1.5 方法
1.5.1 取样。取水产品可食用部分充分绞碎混匀后，称取5.00 g（精确至0.01 g）置于50 ml离心管中。
1.5.2 提取。向离心管中加入15 ml乙腈，充分振荡提取，旋涡混合3 min，5 000 r/min离心分离，重复提取1次，合并2次上清液，并转入250 ml分液漏斗中。
1.5.3 轉容净化。向分液漏斗中加入20 ml 10%氯化钠水溶液，20 ml二氯甲烷，振荡3 min（注意放气），静置分层后，去除下层水相；上层乙腈和二氯甲烷层过预先用乙腈淋洗的无水硫酸钠脱水净化，并收集到茄形瓶中，然后用20 ml乙腈分数次洗涤硫酸钠，滤液一并转入茄形瓶中。
1.5.4 浓缩溶解。加入10 ml异丙醇，40 ℃以下浓缩至干，用2 ml定容溶液溶解残渣。
1.5.5 再净化。残渣溶解液过中性氧化铝，前面3～5滴流出液弃去，全部收集随后的流出液并过0.2 μm滤膜。
2 结果与分析
2.1 标准曲线的相关系数 将浓度分别为0.5、1.0、2.0、50、10 μg/L的混合标准系列，依次进样，进样量均为5 μl，化合物MG、LMG、CV、LCV和BG的标准曲线相关系数分别为0.998 026、0.994 963、0.995 248、0.992 089和0.995 606。
2.2 检测限 进样0.5 μg/L的5种化合物（MG、LMG、CV、LCV、BG）的混合标准物质，将仪器检测限定为1.0μg/L，孔雀石绿（MG）、隐色孔雀石（LMG）、结晶紫（CV）、隐色结晶紫（LCV）和亮绿（BG）在UPLC/MS/MS上的信噪比分别为1 072.37、1 177.39、138.26、39.29和210.35。
2.3 质谱分析结果 从图2可以看出，孔雀石绿、隐色孔雀石、结晶紫、隐色结晶紫和亮绿的保留时间分别为2.22、2.77、2.30、2.57和2.42 min。
2.4 添加回收试验 分别以鱿鱼和章鱼为空白样品进行基质回收试验，在0.1和0.2 μg/kg水平上进行加标回收试验。由表3可知，亮绿、孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫的平均回收率为80.40%～119.70%，相对标准偏差（RSD）为3.4%～6.2%，说明具有良好的准确度和精密度。
3 小结
该试验建立的UPLSMSMS方法避免了目标物的大量损失，在优化的色谱质谱条件下对孔雀石绿（隐）、结晶紫（隐）和亮绿5种化合物实现了有效分离，并且出峰时间合适，检测灵敏度较高，精密度良好，回收率较高，方法检测定量限为5μg/kg，适用性均良好，可满足水产品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫、亮绿5种化合物的检测要求。
图2 5种化合物的质谱图 安徽农业科学 2015年参考文献
[1] 邱绪建，林洪，江洁.渔药孔雀石绿及其关联化合物检测方法研究进展[J].海洋水产研究，2005，26（2）：92-96.
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