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【摘要】 目的：观察δ-阿片受体激动剂DADLE（[D-Ala2，D-Leu5]enkephali）对大鼠急性全脑缺血再灌注后海马区神经元ERK信号通路和Caspase-3表达的影响。方法：将50只SD大鼠随机分为5组：假手术组（Sham）、模型组（I/R）、DADLE处理组（根据不同剂量可分为2 mg/kg[A]、3 mg/kg[B]、5 mg/kg[C]）。采用改良的二血管阻断加低血压法建立全脑缺血再灌注模型。于缺血15 min后经颈外静脉注射DADLE并于再灌注120 min后处死。开颅取其新鲜海马组织，采用western blot检测海马组织Caspase-3的表达，以及采用免疫组织化学法检测非磷酸化ERK与磷酸化ERK（P-ERK）的表达状况。结果：Sham组ERK和P-ERK蛋白表达水平显著低于其他各组（P<0.05），DADLE处理组与I/R组相比，其ERK和P-ERK蛋白的表达量明显上调（P<0.05）。海马组织Caspase-3蛋白表达I/R组较Sham组表达明显上调（P<0.05），而DADLE处理组与IR组比较，海马组织 Caspase-3蛋白表达明显下降（P<0.05）。结论：DADLE对大鼠急性全脑缺血再灌注后海马区神经元有保护作用，说明DADLE可通过上调ERK信号通路以及抑制Caspase-3的表达而起到保护脑组织的作用。
【关键词】 DADLE； 全脑缺血再灌注； ERK； Caspase-3
近来有研究证实，δ-阿片受体（δ-opioid receptor，DOR）对缺血缺氧神经元有保护作用，其中DOR激动剂（[D-Ala2，D-Leu5]enkephalin，DADLE）是目前研究的最为具体、清楚的，且大多数认为其具有明确的脑保护作用[1]。胞外信号调控激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）调控多种重要的细胞生物学过程，包括细胞增殖、分化和凋亡等，而Caspase-3是凋亡过程中的关键蛋白酶，其含量增加，可引发细胞凋亡。因此，本研究旨在通过观察不同剂量的DADLE对大鼠急性全脑缺血再灌注损伤后海马神经元ERK信号通路和Caspase-3表达的影响，探讨其保护作用的可能分子生物学机制，为DADLE防治急性全脑缺血再灌注损伤的临床应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料 DADLE购自美国Sigma公司。兔抗大鼠p44/p42MAPK（ERK）、Phospho-p44/42MAPK（Erk1/2）多克隆抗体以及Caspase-3抗体购于美国CST公司。BL-420E生物机能实验系统由四川泰盟科技有限公司生产，24G×19 mmY型留置针由威海洁瑞医用制品有限公司提供。
1.2 动物及分组 SD大鼠50只，雌性，体重180～220 g，由广州中医药大学动物实验中心提供，合格证号SCXK（粤）2008-0020。于广州医学院实验动物中心喂养，实验前适应喂养1周。大鼠随机分为假手术组（Sham）、模型组（I/R）、DADLE处理组，其中DADLE处理组又分为2 mg/kg（A）、3 mg/kg（B）、5 mg/kg（C）三个亚组，每组各10只。
1.3 二血管阻断加低血压建立大鼠全脑缺血再灌注模型 模型组（I/R）大鼠：2%戊巴比妥（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，取仰卧位固定。切开左侧大腿股部处皮肤，准确分离股动脉后采用静脉留置针行动脉插管，后以缝线固定，通过Y型留置针注射肝素60 IU/kg达到全身肝素化。右侧股动脉以相同的方法行动脉插管，并与BL-420E生物机能实验系统连接，通过生物机能实验系统监测记录动脉血压。颈正中切口，分离双侧颈总动脉和左侧颈静脉，经左侧颈静脉插管建立体外给药途径。通过左侧股动脉插管回抽血液至平均动脉压达30～40 mm Hg，然后用微型动脉夹夹闭双侧颈总动脉，进入缺血期。缺血15 min后移去微型动脉夹去除双侧颈总动脉的夹闭，于左侧股动脉回输血液至血压达到正常（回输速度匀速且缓慢），此为再灌注期，本实验再灌注期时间为120 min。DADLE处理组：于再灌注前经由左侧颈静注射不同剂量的DADLE（A组2 mg/kg 、B组3 mg/kg 、C组 5mg/kg）。Sham组：除了不进行颈动脉夹闭、不抽血、不给药外，其余操作同前。
1.4 免疫组织化学法检测ERK和P-ERK 开颅取大脑经生理盐水漂洗后，将脑组织沿冠状面对半切开置于4%多聚甲醛固定，脱水后常规石蜡包埋。将切片脱蜡、脱水，枸橼酸缓冲液修复抗原，滴加正常山羊血清封闭液，再滴加Phospho-p44/42MAPK多克隆抗体（兔IgG），为浓缩一抗，浓度为1：100，放入湿盒内，滴加生物素标记羊抗兔IgG（1%BSA-PBS稀释），滴加辣根过氧化物酶标记链霉亲和素（稀释和使用方法同二抗），DAB 显色试剂显色。组织切片中显示细胞浆或细胞核有明显黄棕色颗粒或斑片为 ERK阳性。检测P-ERK的步骤同上。
1.5 western blot蛋白印迹检测Caspase-3 取30 μg待测样品及标准蛋白于SDS-PAGE电泳。电泳分离后转膜至PVDF膜上，用TBST配制5%脱脂牛奶进行封闭，于摇床上室温孵育60 min。封闭结束后TBST洗脱3次，每次5 min。按照1∶1000稀释比例加入Caspase-3一抗，4 ℃孵育过夜，之后TBST洗脱3次，每次5 min。再加入用5%脱脂牛奶（1∶10000）稀释的二抗，摇床上室温孵育60 min。孵育结束后TBST室温洗脱3次，每次10 min。最后ECL显色，A液与B液等体积混合，使用X光片曝光，常规方法显影定影。结果运用Image J图像分析软件分析，通过计算目的蛋白光密度值与内参蛋白光密度值的比值来衡量其表达量。
1.6 统计学处理 数据使用SPSS 19.0统计学软件进行分析，计量资料以（x±s）表示，不同处理组间采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果
2.1 各组ERK和P-ERK的表达 Sham组ERK和P-ERK阳性细胞数显著低于其他各组（P<0.05），A组、B组、C组与I/R组相比，其ERK和P-ERK的阳性细胞数明显增加（P<0.05）。而各给药组之间ERK和P-ERK阳性细胞数为B组与C组的表达高于A组（P<0.05），B组与C组间差异无统计学意义（P>0.05）。见表1、图1和图2。
2.2 各组Caspase-3蛋白表达水平 Caspase-3蛋白表达水平为各组目的条带的光密度值比上内参条带的光密度值，Sham组值为（0.3022±0.0432），IR组为（0.9857±0.1381），A组值为（0.5469±0.0864），B组值为（0.3941±0.0595），C组值为（0.4177±0.0679）。IR组与Sham组比较，海马组织Caspase-3蛋白表达明显上调（P<0.05），A组、B组、C组与IR组比较，海马组织 Caspase-3蛋白表达明显下调（P<0.05）。而各给药组之间海马组织Caspase-3蛋白表达为B组与C组的表达低于A组（P<0.05），B组与C组间差异无统计学意义（P>0.05）。见图3。
3 讨论
目前研究发现，缺血性脑损伤涉及到谷氨酸的兴奋性毒性、梗死周围去极化、炎症和延迟性神经元死亡等四个机制，均与胞内信号转导通路MAPK家族的调节有关[2]。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是真核生物中广泛存在的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。胞外信号调控激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）是发现的第1个MAPK，它调控多种重要的细胞生物学过程，包括细胞增殖、分化和凋亡等，特异地阻断ERK通路激活可促进细胞凋亡[3-4]。该激酶被上游蛋白磷酸化后成为活化形式（P-ERK），进一步作用于胞浆内多种信号分子或细胞骨架蛋白，并可直接进入核内通过作用于转录因子，调控基因表达[5]。脑缺血再灌注时ERK活性增加是细胞针对缺氧刺激启动修复过程、促进细胞存活的保护性机制，对于经历了缺血再灌注损伤的神经元具有保护作用。本研究发现，I/R组海马神经元ERK和P-ERK的表达均较Sham组显著升高，DADLE处理后ERK和P-ERK的表达又较I/R组显著升高，而该保护作用是否与DADLE剂量有明显相关，则需作进一步研究。
Caspase家族是哺乳动物凋亡机制中关键因素，而Caspase-3被认为是此级联反应中最关键效应的蛋白酶。正常情况下，胞质中Caspase-3以无活性酶形式存在，被凋亡信号激活后断裂为大小两个亚基并结合为四聚体，成为活性酶，活性的Caspase-3进一步切割不同底物，导致蛋白酶切割联放大，DNA裂解，最终使细胞走向死亡[6-7]。本研究发现，I/R组海马神经元Caspase-3即有大量表达，DADLE处理后Caspase-3的表达均减少，而该保护作用是否与DADLE剂量有明显相关，则需要作进一步研究。
研究证实，δ阿片受体激动剂DADLE对大鼠全脑缺血再灌注损伤有保护作用[8]，DADLE成为近年来研究神经保护的领域中的热点。韩洁韵等[9]初步研究发现，DADLE对全脑缺血再灌注损伤具有保护作用，但其具体保护机制报道较少。本研究结果表明，DADLE处理组较缺血再灌注组的ERK和p-ERK升高明显（P<0.05），提示DADLE可能通过调节ERK和p-ERK的表达起到保护脑组织的作用。Caspase-3是凋亡过程中的关键蛋白酶，Caspase-3蛋白含量增加，可引发细胞凋亡。本实验研究证明，SD大鼠脑缺血再灌注损伤后应用DADLE治疗可明显抑制Caspase-3的升高（P<0.05），说明DADLE可通过抑制Caspase-3的活性升高而起到保护脑组织的作用。
综上所述，DADLE对大鼠急性全脑缺血再灌注后海马区神经元有保护作用，可能与其上调ERK信号通路以及抑制Caspase-3的表达有关。除此外DADLE是否还参与了其他的途径来降低神经元细胞的损伤还有待进一步深入研究。
参考文献
[1] 顾洋，苏殿三.delta阿片受体激动剂脑保护作用的研究进展[J].上海医学，2010，33（8）：784-788.
[2] 李军，曹红，曾邦雄，等.MAPK级联反应与缺血性脑损伤[J].国外医学：麻醉学与复苏分册，2002，23（4）：232-235.
[3] Bo nni A，Brunet A，West A E，et al.Cell surviva；promoted by the Ras-MAPK signaling pathway by transcription dependent and independent mechanisms[J].Science，1999，286（5443）：1358-1362.
[4] Murray B，Alessandrini A，Clie A，et al.Inhibition of the p44/42MAP kinase Pathway Protects hippocampal neurons in a cellculture model of seizure activity[J].Proc Natl Ascad Sci USA，1998，95（20）：11975-11980.
[5] Adams J P，Roberson E D，English J D，et al.MAPK regulation of gene expression in the centralnervous system[J].ActaNeurobiolExp（Wars），2000，60（12）：377-394.
[6] Yuste V J，Sánchez-López I，SoléC，et al.The contribution of apoptosis-inducing factor， caspase-activated DNase， and inhibitor of caspase-activated DNase to the nuclear phenotype and DNA degradation during apoptosis[J].J Biol Chem，2005，280（42）：35670-35683.
[7] Fumarola C，Guidotti G G.Stress-induced apoptosis： toward a symmetry with receptor-mediated cell death[J].Apoptosis，2004，9（1）：77-82.
[8] Liu W Y，Jin Z X.Opioid receptor induced myocardial hibernating and myocardial protection[J].Chin J Ext Circ，2004，2（1）：53-55.
[9] 韩洁韵，梁子敬.δ阿片受体激动剂DADLE对全脑缺血再灌注大鼠大脑组织病理影响[J].广州医学院学报，2008，36（5）：1-4.
（收稿日期：2012-11-21） （本文编辑：陈丹云）
【关键词】 DADLE； 全脑缺血再灌注； ERK； Caspase-3
近来有研究证实，δ-阿片受体（δ-opioid receptor，DOR）对缺血缺氧神经元有保护作用，其中DOR激动剂（[D-Ala2，D-Leu5]enkephalin，DADLE）是目前研究的最为具体、清楚的，且大多数认为其具有明确的脑保护作用[1]。胞外信号调控激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）调控多种重要的细胞生物学过程，包括细胞增殖、分化和凋亡等，而Caspase-3是凋亡过程中的关键蛋白酶，其含量增加，可引发细胞凋亡。因此，本研究旨在通过观察不同剂量的DADLE对大鼠急性全脑缺血再灌注损伤后海马神经元ERK信号通路和Caspase-3表达的影响，探讨其保护作用的可能分子生物学机制，为DADLE防治急性全脑缺血再灌注损伤的临床应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料 DADLE购自美国Sigma公司。兔抗大鼠p44/p42MAPK（ERK）、Phospho-p44/42MAPK（Erk1/2）多克隆抗体以及Caspase-3抗体购于美国CST公司。BL-420E生物机能实验系统由四川泰盟科技有限公司生产，24G×19 mmY型留置针由威海洁瑞医用制品有限公司提供。
1.2 动物及分组 SD大鼠50只，雌性，体重180～220 g，由广州中医药大学动物实验中心提供，合格证号SCXK（粤）2008-0020。于广州医学院实验动物中心喂养，实验前适应喂养1周。大鼠随机分为假手术组（Sham）、模型组（I/R）、DADLE处理组，其中DADLE处理组又分为2 mg/kg（A）、3 mg/kg（B）、5 mg/kg（C）三个亚组，每组各10只。
1.3 二血管阻断加低血压建立大鼠全脑缺血再灌注模型 模型组（I/R）大鼠：2%戊巴比妥（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，取仰卧位固定。切开左侧大腿股部处皮肤，准确分离股动脉后采用静脉留置针行动脉插管，后以缝线固定，通过Y型留置针注射肝素60 IU/kg达到全身肝素化。右侧股动脉以相同的方法行动脉插管，并与BL-420E生物机能实验系统连接，通过生物机能实验系统监测记录动脉血压。颈正中切口，分离双侧颈总动脉和左侧颈静脉，经左侧颈静脉插管建立体外给药途径。通过左侧股动脉插管回抽血液至平均动脉压达30～40 mm Hg，然后用微型动脉夹夹闭双侧颈总动脉，进入缺血期。缺血15 min后移去微型动脉夹去除双侧颈总动脉的夹闭，于左侧股动脉回输血液至血压达到正常（回输速度匀速且缓慢），此为再灌注期，本实验再灌注期时间为120 min。DADLE处理组：于再灌注前经由左侧颈静注射不同剂量的DADLE（A组2 mg/kg 、B组3 mg/kg 、C组 5mg/kg）。Sham组：除了不进行颈动脉夹闭、不抽血、不给药外，其余操作同前。
1.4 免疫组织化学法检测ERK和P-ERK 开颅取大脑经生理盐水漂洗后，将脑组织沿冠状面对半切开置于4%多聚甲醛固定，脱水后常规石蜡包埋。将切片脱蜡、脱水，枸橼酸缓冲液修复抗原，滴加正常山羊血清封闭液，再滴加Phospho-p44/42MAPK多克隆抗体（兔IgG），为浓缩一抗，浓度为1：100，放入湿盒内，滴加生物素标记羊抗兔IgG（1%BSA-PBS稀释），滴加辣根过氧化物酶标记链霉亲和素（稀释和使用方法同二抗），DAB 显色试剂显色。组织切片中显示细胞浆或细胞核有明显黄棕色颗粒或斑片为 ERK阳性。检测P-ERK的步骤同上。
1.5 western blot蛋白印迹检测Caspase-3 取30 μg待测样品及标准蛋白于SDS-PAGE电泳。电泳分离后转膜至PVDF膜上，用TBST配制5%脱脂牛奶进行封闭，于摇床上室温孵育60 min。封闭结束后TBST洗脱3次，每次5 min。按照1∶1000稀释比例加入Caspase-3一抗，4 ℃孵育过夜，之后TBST洗脱3次，每次5 min。再加入用5%脱脂牛奶（1∶10000）稀释的二抗，摇床上室温孵育60 min。孵育结束后TBST室温洗脱3次，每次10 min。最后ECL显色，A液与B液等体积混合，使用X光片曝光，常规方法显影定影。结果运用Image J图像分析软件分析，通过计算目的蛋白光密度值与内参蛋白光密度值的比值来衡量其表达量。
1.6 统计学处理 数据使用SPSS 19.0统计学软件进行分析，计量资料以（x±s）表示，不同处理组间采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果
2.1 各组ERK和P-ERK的表达 Sham组ERK和P-ERK阳性细胞数显著低于其他各组（P<0.05），A组、B组、C组与I/R组相比，其ERK和P-ERK的阳性细胞数明显增加（P<0.05）。而各给药组之间ERK和P-ERK阳性细胞数为B组与C组的表达高于A组（P<0.05），B组与C组间差异无统计学意义（P>0.05）。见表1、图1和图2。
2.2 各组Caspase-3蛋白表达水平 Caspase-3蛋白表达水平为各组目的条带的光密度值比上内参条带的光密度值，Sham组值为（0.3022±0.0432），IR组为（0.9857±0.1381），A组值为（0.5469±0.0864），B组值为（0.3941±0.0595），C组值为（0.4177±0.0679）。IR组与Sham组比较，海马组织Caspase-3蛋白表达明显上调（P<0.05），A组、B组、C组与IR组比较，海马组织 Caspase-3蛋白表达明显下调（P<0.05）。而各给药组之间海马组织Caspase-3蛋白表达为B组与C组的表达低于A组（P<0.05），B组与C组间差异无统计学意义（P>0.05）。见图3。
3 讨论
目前研究发现，缺血性脑损伤涉及到谷氨酸的兴奋性毒性、梗死周围去极化、炎症和延迟性神经元死亡等四个机制，均与胞内信号转导通路MAPK家族的调节有关[2]。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是真核生物中广泛存在的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。胞外信号调控激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）是发现的第1个MAPK，它调控多种重要的细胞生物学过程，包括细胞增殖、分化和凋亡等，特异地阻断ERK通路激活可促进细胞凋亡[3-4]。该激酶被上游蛋白磷酸化后成为活化形式（P-ERK），进一步作用于胞浆内多种信号分子或细胞骨架蛋白，并可直接进入核内通过作用于转录因子，调控基因表达[5]。脑缺血再灌注时ERK活性增加是细胞针对缺氧刺激启动修复过程、促进细胞存活的保护性机制，对于经历了缺血再灌注损伤的神经元具有保护作用。本研究发现，I/R组海马神经元ERK和P-ERK的表达均较Sham组显著升高，DADLE处理后ERK和P-ERK的表达又较I/R组显著升高，而该保护作用是否与DADLE剂量有明显相关，则需作进一步研究。
Caspase家族是哺乳动物凋亡机制中关键因素，而Caspase-3被认为是此级联反应中最关键效应的蛋白酶。正常情况下，胞质中Caspase-3以无活性酶形式存在，被凋亡信号激活后断裂为大小两个亚基并结合为四聚体，成为活性酶，活性的Caspase-3进一步切割不同底物，导致蛋白酶切割联放大，DNA裂解，最终使细胞走向死亡[6-7]。本研究发现，I/R组海马神经元Caspase-3即有大量表达，DADLE处理后Caspase-3的表达均减少，而该保护作用是否与DADLE剂量有明显相关，则需要作进一步研究。
研究证实，δ阿片受体激动剂DADLE对大鼠全脑缺血再灌注损伤有保护作用[8]，DADLE成为近年来研究神经保护的领域中的热点。韩洁韵等[9]初步研究发现，DADLE对全脑缺血再灌注损伤具有保护作用，但其具体保护机制报道较少。本研究结果表明，DADLE处理组较缺血再灌注组的ERK和p-ERK升高明显（P<0.05），提示DADLE可能通过调节ERK和p-ERK的表达起到保护脑组织的作用。Caspase-3是凋亡过程中的关键蛋白酶，Caspase-3蛋白含量增加，可引发细胞凋亡。本实验研究证明，SD大鼠脑缺血再灌注损伤后应用DADLE治疗可明显抑制Caspase-3的升高（P<0.05），说明DADLE可通过抑制Caspase-3的活性升高而起到保护脑组织的作用。
综上所述，DADLE对大鼠急性全脑缺血再灌注后海马区神经元有保护作用，可能与其上调ERK信号通路以及抑制Caspase-3的表达有关。除此外DADLE是否还参与了其他的途径来降低神经元细胞的损伤还有待进一步深入研究。
参考文献
[1] 顾洋，苏殿三.delta阿片受体激动剂脑保护作用的研究进展[J].上海医学，2010，33（8）：784-788.
[2] 李军，曹红，曾邦雄，等.MAPK级联反应与缺血性脑损伤[J].国外医学：麻醉学与复苏分册，2002，23（4）：232-235.
[3] Bo nni A，Brunet A，West A E，et al.Cell surviva；promoted by the Ras-MAPK signaling pathway by transcription dependent and independent mechanisms[J].Science，1999，286（5443）：1358-1362.
[4] Murray B，Alessandrini A，Clie A，et al.Inhibition of the p44/42MAP kinase Pathway Protects hippocampal neurons in a cellculture model of seizure activity[J].Proc Natl Ascad Sci USA，1998，95（20）：11975-11980.
[5] Adams J P，Roberson E D，English J D，et al.MAPK regulation of gene expression in the centralnervous system[J].ActaNeurobiolExp（Wars），2000，60（12）：377-394.
[6] Yuste V J，Sánchez-López I，SoléC，et al.The contribution of apoptosis-inducing factor， caspase-activated DNase， and inhibitor of caspase-activated DNase to the nuclear phenotype and DNA degradation during apoptosis[J].J Biol Chem，2005，280（42）：35670-35683.
[7] Fumarola C，Guidotti G G.Stress-induced apoptosis： toward a symmetry with receptor-mediated cell death[J].Apoptosis，2004，9（1）：77-82.
[8] Liu W Y，Jin Z X.Opioid receptor induced myocardial hibernating and myocardial protection[J].Chin J Ext Circ，2004，2（1）：53-55.
[9] 韩洁韵，梁子敬.δ阿片受体激动剂DADLE对全脑缺血再灌注大鼠大脑组织病理影响[J].广州医学院学报，2008，36（5）：1-4.
（收稿日期：2012-11-21） （本文编辑：陈丹云）