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摘 要 白星病是贵州省茶叶生产的重要限制因素。提高贵州省茶叶品种的抗病性，对促进贵州省茶叶产量提高、品质改善具有重大的战略和现实意义。初步分析表明：茶叶CsMYBantif为MYB类转录因子，受白星病菌侵染以及旱处理、盐处理等非生物胁迫诱导表达。该基因是茶树遗传资源改良的重要候选基因。下一步需要揭示该基因响应白星病菌侵染的分子机理，为培育抗白星病茶树新品种或新种质储备基因资源。
关键词 茶树；白星病；转录因子；CsMYBantif
中图分类号：Q943.2 文献标志码：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2016.35.038
我国是世界上最大的茶叶生产国，也是重要的茶叶贸易国，茶叶产业在我国国民经济中占有重要的地位。茶白星病在我国安徽、福建、贵州、四川、江西、湖南和云南等茶叶产区均有发生。茶树感染白星病后，新梢生长不良、芽重减轻、叶片易脱落，发病茶园一般减产10%左右，病重茶园减产50%以上，甚至片叶无收，该病已发展成为我国茶叶高产优质的重要限制因素之一。
培育和大范围应用高抗白星病茶叶品种是遏制白星病病害、提高茶园效益的重要途径。借助于现代分子生物学技术，通过转基因手段与常规育种有机结合应该是破解茶叶抗白星病育种难题的新的出路。而目前，茶叶抗白星病转基因育种的一个瓶颈是缺乏有效的抗性基因。对茶叶白星病抗性进行分子机理研究，克隆茶叶抗白星病相关基因，研究其致病/抗病机制是茶叶抗病育种的基础和前提。
目前，茶叶抗白星病的研究还集中在生理和田间病害发生调查方面，白星病菌侵染茶树的分子机理研究还十分薄弱。曾明森研究表明，茶白星病菌以菌丝体或分生孢子器的形式在茶树病叶、病梢及落叶中越冬。次年春天，茶树幼叶初展时期，白星病菌的分生孢子器便会释放出大量分生孢子，通过风雨传播，在湿度适宜时侵入幼嫩芽叶、新梢致病。经2～5 d潜伏期，茶树幼嫩新叶上便会表现出病斑，病斑上又会产生分生孢子再侵染，使病害不断扩展蔓延。若外界条件适宜，此病害便会大范围的流行。
茶叶白星病属低温高湿型病害，当平均温度约为20 ℃，相对湿度达80%时，最利于白星病害发生。在适合发病的季节，若连续3～5 d阴雨，白星病便会爆发。此病发生期早，流行时间长。一般发生始期为3月下旬，流行期从4月上旬至6月上旬。贵州省高山茶园由于多雾、阴湿、低温，故白星病发生尤其频繁，为害剧烈。
克隆茶叶抗病基因，研究其抗病机制是茶叶抗白星病育种的基础和前提。在长期的生物进化过程中，植物自身已经发展了多种通过调节自身生理和代谢变化来抵御病菌侵染的机制。其中的一个重要机制就是通过病菌侵染信号转导来启动抗病响应基因的表达。在病菌侵染信号转导途径中，转录因子由于能够调节多个响应功能基因的表达而备受关注。在拟南芥基因组已发现1 600多个转录因子，约为基因总数的6%。MYB转录因子是其中数目最多的一类。MYB基因家族参与植物的各种发育生理过程，如器官形态建成、细胞周期、信号传导、次生代谢、生物和非生物胁迫应答以及ABA的敏感性等。
本研究利用茶树已有的基因组序列信息，从贵州优良、特异品种遵义毛峰中克隆到一个新的MYB转录因子CsMYBantif。实时定量表达分析发现CsMYBantif基因可能在茶叶生物和非生物胁迫反应中起重要调控作用，是茶树抗逆性遗传改良的重要候选基因。因此，有必要研究清楚CsMYBantif转录因子的功能及其在白星病菌胁迫响应中的调控网络，为茶树的抗病育种提供基因资源。
1 材料与方法
1.1 CsMYBantif基因克隆
将遵义毛峰幼苗种于花盆中，在25 ℃培养室中培养。选取生长一致幼苗的根、茎、叶，用于不同组织的表达特性分析；选取长势一致的幼苗，取幼嫩叶片部位用于RNA提取和表达分析。利用Trizol（Invitrogen）法提取根、茎和叶组织的总RNA，利用定量PCR分析CsMYBantif的时空表达特性。
1.2 CsMYBantif生物信息学分析
基因序列克隆后，利用orf finder找出对应氨基酸序列。系统进化树构建使用MEGA6.0软件。基因序列的结构分析使用在线软件GSDS（http：//gsds1.cbi.pku.edu.cn/）。氨基酸序列的结构特征分析使用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）在线工具。
2 结果与分析
2.1 茶叶CsMYBantif基因克隆
根据测序结果设计引物，在遵义毛峰cDNA中扩增出目的基因片段，如图1所示，条带大小在900～1 000 bp。克隆测序后显示该基因编码序列（Coding sequence，CDS）为696 bp，可编码231个氨基酸，所编码氨基酸序列的序列为：MAPRVNFPQRTRTQFLPSSGVKRRMPSPPQVSASSESSDGFPPEPPMAAANGKRRREVEEEVNGADSGHRTQGLRELAQAIRRFGEVYERVELAKREQELRMERDRLEAARELEDQRVQFFLKMQMELSKANNAGASAAAAAVGAVATAIAAADGNGTRRTAMATDVGTSSNHHVRYRFKDSRHCHAAPQQPQHQYNENNAAEAARGTGNGSDTDNKEDEDEAEDEEDESQ。
2.2 CsMYBantif響应生物胁迫和非生物胁迫
选取生长一致的幼苗，分别进行培养液（CK）、PEG、NaCl、白星病菌侵染、4 ℃低温及H202处理后，通过实时定量PCR检测CsMYBantif在茶树叶片中的表达变化情况，如图2所示。结果表明，在白星病菌液侵染后，CsMYBantif在叶中的表达较对照极显著增强，为对照的45倍（P<0.000 1），而在PEG、NaCl、低温和H202处理后，CsMYBantif在叶中的表达与对照相比也有明显增加，说明在叶中响应生物胁迫和非生物胁迫方面，CsMYBantif具有重要的功能。
3 结论
茶白星病是贵州省茶叶生产的重要限制因素。茶树感染白星病后，产量会严重减少，质量急剧下降。茶白星病是我国茶叶高产优质的重要限制因素。本文利用茶树已有的基因组序列信息，从贵州优良、特异品种遵义毛峰中克隆到一个新的MYB转录因子CsMYBantif。实时定量表达分析发现CsMYBantif基因在白星病菌侵染后表达显著上调，可能在茶叶生物和非生物胁迫反应中起重要调控作用，是茶树抗逆性遗传改良的重要候选基因。
下一步有必要研究清楚CsMYBantif转录因子的功能及其在白星病菌胁迫响应中的调控网络，为茶树的抗病育种提供基因资源。
（责任编辑：刘昀）
关键词 茶树；白星病；转录因子；CsMYBantif
中图分类号：Q943.2 文献标志码：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2016.35.038
我国是世界上最大的茶叶生产国，也是重要的茶叶贸易国，茶叶产业在我国国民经济中占有重要的地位。茶白星病在我国安徽、福建、贵州、四川、江西、湖南和云南等茶叶产区均有发生。茶树感染白星病后，新梢生长不良、芽重减轻、叶片易脱落，发病茶园一般减产10%左右，病重茶园减产50%以上，甚至片叶无收，该病已发展成为我国茶叶高产优质的重要限制因素之一。
培育和大范围应用高抗白星病茶叶品种是遏制白星病病害、提高茶园效益的重要途径。借助于现代分子生物学技术，通过转基因手段与常规育种有机结合应该是破解茶叶抗白星病育种难题的新的出路。而目前，茶叶抗白星病转基因育种的一个瓶颈是缺乏有效的抗性基因。对茶叶白星病抗性进行分子机理研究，克隆茶叶抗白星病相关基因，研究其致病/抗病机制是茶叶抗病育种的基础和前提。
目前，茶叶抗白星病的研究还集中在生理和田间病害发生调查方面，白星病菌侵染茶树的分子机理研究还十分薄弱。曾明森研究表明，茶白星病菌以菌丝体或分生孢子器的形式在茶树病叶、病梢及落叶中越冬。次年春天，茶树幼叶初展时期，白星病菌的分生孢子器便会释放出大量分生孢子，通过风雨传播，在湿度适宜时侵入幼嫩芽叶、新梢致病。经2～5 d潜伏期，茶树幼嫩新叶上便会表现出病斑，病斑上又会产生分生孢子再侵染，使病害不断扩展蔓延。若外界条件适宜，此病害便会大范围的流行。
茶叶白星病属低温高湿型病害，当平均温度约为20 ℃，相对湿度达80%时，最利于白星病害发生。在适合发病的季节，若连续3～5 d阴雨，白星病便会爆发。此病发生期早，流行时间长。一般发生始期为3月下旬，流行期从4月上旬至6月上旬。贵州省高山茶园由于多雾、阴湿、低温，故白星病发生尤其频繁，为害剧烈。
克隆茶叶抗病基因，研究其抗病机制是茶叶抗白星病育种的基础和前提。在长期的生物进化过程中，植物自身已经发展了多种通过调节自身生理和代谢变化来抵御病菌侵染的机制。其中的一个重要机制就是通过病菌侵染信号转导来启动抗病响应基因的表达。在病菌侵染信号转导途径中，转录因子由于能够调节多个响应功能基因的表达而备受关注。在拟南芥基因组已发现1 600多个转录因子，约为基因总数的6%。MYB转录因子是其中数目最多的一类。MYB基因家族参与植物的各种发育生理过程，如器官形态建成、细胞周期、信号传导、次生代谢、生物和非生物胁迫应答以及ABA的敏感性等。
本研究利用茶树已有的基因组序列信息，从贵州优良、特异品种遵义毛峰中克隆到一个新的MYB转录因子CsMYBantif。实时定量表达分析发现CsMYBantif基因可能在茶叶生物和非生物胁迫反应中起重要调控作用，是茶树抗逆性遗传改良的重要候选基因。因此，有必要研究清楚CsMYBantif转录因子的功能及其在白星病菌胁迫响应中的调控网络，为茶树的抗病育种提供基因资源。
1 材料与方法
1.1 CsMYBantif基因克隆
将遵义毛峰幼苗种于花盆中，在25 ℃培养室中培养。选取生长一致幼苗的根、茎、叶，用于不同组织的表达特性分析；选取长势一致的幼苗，取幼嫩叶片部位用于RNA提取和表达分析。利用Trizol（Invitrogen）法提取根、茎和叶组织的总RNA，利用定量PCR分析CsMYBantif的时空表达特性。
1.2 CsMYBantif生物信息学分析
基因序列克隆后，利用orf finder找出对应氨基酸序列。系统进化树构建使用MEGA6.0软件。基因序列的结构分析使用在线软件GSDS（http：//gsds1.cbi.pku.edu.cn/）。氨基酸序列的结构特征分析使用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）在线工具。
2 结果与分析
2.1 茶叶CsMYBantif基因克隆
根据测序结果设计引物，在遵义毛峰cDNA中扩增出目的基因片段，如图1所示，条带大小在900～1 000 bp。克隆测序后显示该基因编码序列（Coding sequence，CDS）为696 bp，可编码231个氨基酸，所编码氨基酸序列的序列为：MAPRVNFPQRTRTQFLPSSGVKRRMPSPPQVSASSESSDGFPPEPPMAAANGKRRREVEEEVNGADSGHRTQGLRELAQAIRRFGEVYERVELAKREQELRMERDRLEAARELEDQRVQFFLKMQMELSKANNAGASAAAAAVGAVATAIAAADGNGTRRTAMATDVGTSSNHHVRYRFKDSRHCHAAPQQPQHQYNENNAAEAARGTGNGSDTDNKEDEDEAEDEEDESQ。
2.2 CsMYBantif響应生物胁迫和非生物胁迫
选取生长一致的幼苗，分别进行培养液（CK）、PEG、NaCl、白星病菌侵染、4 ℃低温及H202处理后，通过实时定量PCR检测CsMYBantif在茶树叶片中的表达变化情况，如图2所示。结果表明，在白星病菌液侵染后，CsMYBantif在叶中的表达较对照极显著增强，为对照的45倍（P<0.000 1），而在PEG、NaCl、低温和H202处理后，CsMYBantif在叶中的表达与对照相比也有明显增加，说明在叶中响应生物胁迫和非生物胁迫方面，CsMYBantif具有重要的功能。
3 结论
茶白星病是贵州省茶叶生产的重要限制因素。茶树感染白星病后，产量会严重减少，质量急剧下降。茶白星病是我国茶叶高产优质的重要限制因素。本文利用茶树已有的基因组序列信息，从贵州优良、特异品种遵义毛峰中克隆到一个新的MYB转录因子CsMYBantif。实时定量表达分析发现CsMYBantif基因在白星病菌侵染后表达显著上调，可能在茶叶生物和非生物胁迫反应中起重要调控作用，是茶树抗逆性遗传改良的重要候选基因。
下一步有必要研究清楚CsMYBantif转录因子的功能及其在白星病菌胁迫响应中的调控网络，为茶树的抗病育种提供基因资源。
（责任编辑：刘昀）