【摘 要】
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目的对人Survivin基因进行克隆,制备和鉴定针对人Survivin的单克隆抗体,检测Survivin在肝癌中的表达.方法利用RT-PCR方法从人乳腺癌细胞MCF-7扩增克隆Survivin 基因,构建可表
【基金项目】
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北京市高技术肿瘤分子生物学实验室基金;
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目的对人Survivin基因进行克隆,制备和鉴定针对人Survivin的单克隆抗体,检测Survivin在肝癌中的表达.方法利用RT-PCR方法从人乳腺癌细胞MCF-7扩增克隆Survivin 基因,构建可表达Survivin蛋白的原核表达载体,在大肠杆菌中表达MS-Survivin融合蛋白.以纯化的融合蛋白免疫BALB/C小鼠,取其脾细胞,用传统杂交瘤技术与小鼠骨髓瘤细胞融合及次黄嘌呤、氨基蝶呤与胸苷选择性培养.单克隆杂交瘤上清经ELISA双筛后,进行亚类和Western blot分析.免疫化学方法检测Survivin在肝癌中的表达情况.结果克隆了429 bp的Survivin全长基因.经ELISA双筛,获得了4株能稳定分泌针对Survivin的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其分泌抗体亚类均为IgG1.Western blot结果显示,抗Survivin单抗可与MS-Survivin融合蛋白呈特异性结合.免疫细胞化学显示,该单抗与人肝癌HepG2细胞株呈阳性反应,并且可与肝癌组织结合,呈强阳性反应.结论以分子生物学技术克隆了凋亡抑制因子人Survivin基因,通过原核表达产物制备并纯化了针对Survivin的单克隆抗体,Survivin可在肝癌细胞和肝癌组织中表达,为深入研究Survivin的功能和临床检测肿瘤组织及体液中的Survivin奠定了可靠基础.
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