鸟肠球菌(Enterococcus avium)中α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆表达及酶学性质

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[背景]前期工作中筛选出一株产α-L-鼠李糖苷酶的细菌,经分子生物学方法鉴定为鸟肠球菌(Enterococcus avium).α-L-鼠李糖苷酶能够从天然类黄酮化合物中特异性切割末端鼠李糖,在食品生产、医药加工和化工等方面具有极大的开发前景和应用价值.[目的]克隆、表达鸟肠球菌中α-L-鼠李糖苷酶基因,进一步对重组蛋白的酶学性质进行研究.[方法]以鸟肠球菌(Enterococcus avium) strain 352基因组中推定的α-L-鼠李糖苷酶基因序列为基础,设计特异性引物扩增其编码区序列.以pET-28a(+)为载体构建重组表达质粒,将重组蛋白在Escherichia coli BL21 (DE3)感受态细胞中进行诱导表达.使用镍亲和层析纯化重组蛋白,以pNPR为底物测定重组蛋白的酶学性质.[结果]重组蛋白EaRha1分子量大小约为130 kDa.以pNPR为底物,EaRha1最适pH是7.0,最适温度为50℃,在pH 5.0-8.0稳定性较好,在40℃以下能保持较高酶活.金属离子对EaRha1有不同程度的促进或抑制作用.甲醇对EaRha1有抑制作用,并且抑制作用随着甲醇浓度的增大而增强.酶动力学常数Km和Vmax分别为0.35 mmol/L和4.2 μmol/(mg·min) (R2=0.999).EaRha1能催化水解新橙皮苷、柚皮苷和芦丁.[结论]通过对重组蛋白EaRha1酶学性质的研究,确定了该蛋白对黄酮类化合物的水解特性,为黄酮类化合物的生物转化奠定了理论基础.
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