论文部分内容阅读
摘要：为探讨蛋白质泛素化与牦牛杂交后代睾丸精子发生异常的相关性，比较了参与泛素化的2种酶基因（泛素结合酶基因Ube2n、泛素连接酶基因Trim36）在成年牦牛和雄性不育犏牛睾丸中的mRNA水平。定量PCR分析显示，牦牛（n=9）睾丸中Ube2n、Trim36基因的mRNA水平分别显著、极显著高于犏牛（n=7），其中Trim36 mRNA水平相差10倍以上。研究结果提示，犏牛睾丸蛋白质泛素化水平明显下降，可能会影响精子发生过程中正常的蛋白质更新。
关键词：牦牛；杂交雄性不育；睾丸；蛋白质降解；泛素化
中图分类号： S823.82；Q786 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）01-0019-03
牦牛（Bos grunniens）主要分布在中国，数量3 000万头以上，是青藏高原特有的牛种和畜牧业主体。牦牛与普通牛（Bos taurus）的杂交后代称为犏牛，具有明显的杂种优势，产乳和产肉量显著提高，但表现为回交三代内雄性不育，无法产生正常精子[1]，而雌性杂交后代生殖正常，其分子机制尚未明确。
已有研究表明，犏牛睾丸中很多生殖相关基因的mRNA或蛋白质水平均显著低于其亲本牦牛和黄牛，如SYCP3、Boule、Dazl、Dmrt7、Dmc1等[2-5]。也存在少量蛋白质在犏牛睾丸中上调的情况[6]。也有研究表明，犏牛睾丸中细胞凋亡增加[7]。尽管目前犏牛雄性不育的分子机制尚不明确，但总体认为，犏牛雄性不育的机制可能涉及精子发生过程中复杂的基因调控网络，并与睾丸中多种特异或非特异蛋白质的异常表达有关。然而，这些变化是否影响睾丸中蛋白质降解尚不明确。鉴于蛋白质泛素化在蛋白质降解中的重要作用，本研究比较牦牛与犏牛睾丸中与泛素化相关的泛素结合酶（Ubiquitin-conjugating enzyme E2 N，Ube2n）、泛素连接酶（E3 ubiquitin-protein ligase TRIM36，Trim36）基因的mRNA水平，以探讨泛素化与犏牛雄性不育是否具有相关性。
1 材料与方法
1.1 样品的采集
麦洼牦牛（Bosgrunniens）和犏牛（公黄牛与母麦洼牦牛的杂交F1代）的睾丸组织于秋季采自四川省成都市近郊某屠宰场。健康的成年公牦牛（n=9）和雄性不育公犏牛（n=7）在屠宰后立刻取其睾丸，切成适当大小后，与干冰一同带回实验室，于-80 ℃下保存备用。本研究对牦牛和犏牛睾丸均进行常规组织切片分析，证实犏牛睾丸中无精子。
1.2 主要试剂和仪器
RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit购自美国Thermo Scientific公司，Trizol Reagent购自美国Ambion公司，QuantiFast SYBR Green PCR Kit购自德国QIAGEN公司，Super Taq DNA Polymerase购自美国GeneCopoeia公司。
C1000 Thermal Cycler型梯度PCR仪、C1000 Touch Thermal Cycler型荧光定量PCR儀、Versa Doc 1000型凝胶成像系统均为美国Bio-Rad公司产品，CR21G型高速冷冻离心机为日本日立公司产品。
1.3 总RNA的提取及反转录
采用Trizol法并按照试剂盒说明书提取牦牛睾丸的总RNA，采用核酸蛋白检测仪测定核酸浓度。采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit以2 μg总RNA为模板，利用随机引物进行反转录获得cDNA。
1.4 睾丸组织Ube2n和Trim36基因的定量PCR分析
参照普通牛的Ube2n（NM_001076258）、Trim36（XM_005890859）、内参基因GAPDH（NM_001034034）、18S RNA（NR_036642）序列，采用Primer Premier 5.0软件分别设计定量PCR引物（表1）。分别对上述4个基因进行PCR扩增，产物纯化后经10倍梯度稀释作为模板，进行荧光定量PCR扩增。利用定量PCR仪上的软件绘制标准曲线。表1 引物序列
目的基因引物（5′→3′） 产物长度（bp）Ube2nF：CCTTAGAGGGCATCAGATCCTCAG；R：AAGGTTCCAACCCACAGGTTAACA240Trim36F：TCTATGGCTCATTGGTAATAAGTAT；R：AAACCACCCAAGAAAGAGTATCT185GAPDHF：CGACTTCAACAGCGACACTCA；R：GGTCCAGGGACCTTACTCCTT16918S RNAF：CTGAGAAACGGCTACCACATC；R：CAGACTTGCCCTCCAATGG168
以反转录的牦牛和犏牛睾丸组织cDNA为模板，采用实时荧光定量PCR方法检测Ube2n、Trim36基因在睾丸中的相对表达量。25 μL PCR体系为：2×QuantiFast SYBR Green PCR Master Mix 12.5 μL、上游及下游引物各1 μL、模板cDNA 1 μL、RNase-free water 9.5 μL。PCR程序为：95 ℃预变性 5 min；95 ℃变性15 s，64 ℃退火15 s（Ube2n）或54 ℃退火20 s（Trim36），72 ℃延伸15 s，共40个循环。于65～95 ℃下制作溶解曲线。
1.5 数据统计
采用2-ΔΔCT法计算目的基因在睾丸中的mRNA水平。采用双内参GAPDH和18S RNA的几何平均数进行标准化，以牦牛睾丸的表达量为对照。试验数据以“平均值±标准误”表示，采用SPSS 18.0软件对荧光定量数据进行t检验。 2 结果与分析
2.1 Ube2n和Trim36基因表达的荧光定量PCR分析方法
本研究提取的睾丸RNA质量经核酸蛋白检测仪和琼脂糖凝胶电泳系统的检测分析，浓度和质量均符合要求。本试验建立了牦牛Ube2n和Trim36基因mRNA的定量PCR检测方法，采用双内参基因进行标准化。目的基因和内参基因扩增的特异性高（图1），扩增效率为98.6%～103.8%，标准曲线线性关系较好（R2约为0.99），符合所用仪器的定量及相应算法要求。
2.2 牦牛和犏牛睾丸组织Ube2n、Trim36基因mRNA水平的比较
对成年牦牛和雄性不育犏牛睾丸中Ube2n、Trim36基因mRNA水平的定量PCR检测显示，犏牛睾丸中Ube2n、Trim36基因的mRNA水平分别显著、极显著低于牦牛，其中Ube2n mRNA水平相差约2倍，而Trim36 mRNA水平相差10倍以上（图2）。
3 结论与讨论
蛋白质的泛素化是其在细胞中降解的关键，在调节各种细胞生物学过程（细胞周期、DNA损伤的修复、信号转导等）中发挥重要作用，涉及3种酶的参与以及多种修饰模式[8-9]。本研究在mRNA水平证实，2种参与泛素化的酶基因（Ube2n、Trim36）在犏牛睾丸中的表达均显著下降，提示犏牛睾丸中蛋白质的泛素化降解可能存在异常。牦牛和犏牛睾丸中Ube2n、Trim36基因mRNA的变化趋势与其蛋白质水平的变化趋势相同[6]（部分为待发表资料），进一步验证了参与泛素化的2种酶在犏牛睾丸中表达异常。
犏牛的杂种优势具有重要的应用价值，但其雄性不育在很大程度上制约了犏牛的高效利用。犏牛睾丸组织中无精子[7]，精子发生受阻很可能与减数分裂异常有关。犏牛睾丸中很多与生殖相关的基因表达下调[2-7]，但与其雄性不育的因果关系尚未明确。犏牛睾丸组织泛素化水平降低与其精子发生异常是否存在关联，需要进一步研究证实。笔者推测，由于犏牛睾丸中多数蛋白质的表达水平可能下降[2-7]，其泛素化水平的降低很可能是适应蛋白质水平改变的结果。Ube2n和Trim36 mRNA水平在犏牛睾丸中的显著下降或许不是犏牛雄性不育的关键原因，但其机制可能涉及睾丸精子发生过程中复杂的网络调控。精子发生过程中减数分裂异常的原因很多，如生殖隔离中减数分裂前期DNA双链断裂（DSB）不能修复、染色体联会或重组异常等[10]。这种DNA的修复或许直接导致蛋白质泛素化修饰相关酶的改变，已有研究表明，参与DNA双链断裂修复的蛋白质或DNA损伤可通过一些机制影响其他蛋白质的泛素化[11-12]。雄性不育犏牛睾丸组织Ube2n和Trim36 mRNA水平显著下降， 是其精子发生异常所涉及的基因网络调控的一部分。
参考文献：
[1]张旭静. 牦牛和普通牛种间杂种公牛睾丸的组织学观测与研究[J]. 畜牧兽医学报，2001，32（4）：314-318.
[2]屈旭光，李齐发，刘振山，等. 牦牛、犏牛睾丸组织中SYCP3基因mRNA表达水平研究[J]. 畜牧兽医学报，2008，39（8）：1132-1136.
[3]付 永，魏雅萍，吴克选，等. Real-time PCR检测黄牛、牦牛、犏牛睾丸组织中Boule、Dazl基因mRNA表达[J]. 生物技术通报，2012（10）：150-155.
[4]金 帅，郭 宪，包鹏甲，等. 牦牛和犏牛Dmrt7基因序列分析及其在睾丸组织中的表达水平[J]. 中国农业科学，2013，46（5）：1036-1043.
[5]李 贤，李齐发，赵兴波，等. 牦牛和犏牛Dmc1基因序列分析及睾丸组织转录水平研究[J]. 中国农业科学，2010，43（15）：3221-3229.
[6]付 伟，李彩霞，刘文静，等. 利用双向电泳-质谱技术鉴定牦牛和犏牛睾丸中的差异表达蛋白质[J]. 西南民族大学学报（自然科学版），2014，40（1）：11-15.
[7]Lou Y N，Liu W J，Wang C L，et al. Histological evaluation and Prdm9 expression level in the testis of sterile male cattle-yaks[J]. Livestock Science，2014，160：208-213.
[8]Komander D，Rape M. The ubiquitin code[J]. Annual Review of Biochemistry，2012，81：203-229.
[9]何 玲，张令强. 线性泛素化修饰研究进展[J]. 遗传，2015，37（9）：911-917.
[10]Li X C，Barringer B C，Barbash D A. The pachytene checkpoint and its relationship to evolutionary patterns of polyploidization and hybrid sterility[J]. Heredity，2009，102（1）：24-30.
[11]Shang Z F，Tan W，Liu X D，et al. DNA-PKcs negatively regulates cyclin B1 protein stability through facilitating its ubiquitination mediated by Cdh1-APC/C pathway[J]. International Journal of Biological Sciences，2015，11（9）：1026-1035.
[12]Jiang Z H，Dong X W，Shen Y C，et al. DNA damage regulates ARID1A stability via SCF ubiquitin ligase in gastric cancer cells[J]. European Review for Medical and Pharmacological Sciences，2015，19（17）：3194-3200.姚紹嫦，谭文明，蓝祖栽，等. 海南冬青组培快繁体系的建立[J]. 江苏农业科学，2017，45（1）：22-26.
关键词：牦牛；杂交雄性不育；睾丸；蛋白质降解；泛素化
中图分类号： S823.82；Q786 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）01-0019-03
牦牛（Bos grunniens）主要分布在中国，数量3 000万头以上，是青藏高原特有的牛种和畜牧业主体。牦牛与普通牛（Bos taurus）的杂交后代称为犏牛，具有明显的杂种优势，产乳和产肉量显著提高，但表现为回交三代内雄性不育，无法产生正常精子[1]，而雌性杂交后代生殖正常，其分子机制尚未明确。
已有研究表明，犏牛睾丸中很多生殖相关基因的mRNA或蛋白质水平均显著低于其亲本牦牛和黄牛，如SYCP3、Boule、Dazl、Dmrt7、Dmc1等[2-5]。也存在少量蛋白质在犏牛睾丸中上调的情况[6]。也有研究表明，犏牛睾丸中细胞凋亡增加[7]。尽管目前犏牛雄性不育的分子机制尚不明确，但总体认为，犏牛雄性不育的机制可能涉及精子发生过程中复杂的基因调控网络，并与睾丸中多种特异或非特异蛋白质的异常表达有关。然而，这些变化是否影响睾丸中蛋白质降解尚不明确。鉴于蛋白质泛素化在蛋白质降解中的重要作用，本研究比较牦牛与犏牛睾丸中与泛素化相关的泛素结合酶（Ubiquitin-conjugating enzyme E2 N，Ube2n）、泛素连接酶（E3 ubiquitin-protein ligase TRIM36，Trim36）基因的mRNA水平，以探讨泛素化与犏牛雄性不育是否具有相关性。
1 材料与方法
1.1 样品的采集
麦洼牦牛（Bosgrunniens）和犏牛（公黄牛与母麦洼牦牛的杂交F1代）的睾丸组织于秋季采自四川省成都市近郊某屠宰场。健康的成年公牦牛（n=9）和雄性不育公犏牛（n=7）在屠宰后立刻取其睾丸，切成适当大小后，与干冰一同带回实验室，于-80 ℃下保存备用。本研究对牦牛和犏牛睾丸均进行常规组织切片分析，证实犏牛睾丸中无精子。
1.2 主要试剂和仪器
RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit购自美国Thermo Scientific公司，Trizol Reagent购自美国Ambion公司，QuantiFast SYBR Green PCR Kit购自德国QIAGEN公司，Super Taq DNA Polymerase购自美国GeneCopoeia公司。
C1000 Thermal Cycler型梯度PCR仪、C1000 Touch Thermal Cycler型荧光定量PCR儀、Versa Doc 1000型凝胶成像系统均为美国Bio-Rad公司产品，CR21G型高速冷冻离心机为日本日立公司产品。
1.3 总RNA的提取及反转录
采用Trizol法并按照试剂盒说明书提取牦牛睾丸的总RNA，采用核酸蛋白检测仪测定核酸浓度。采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit以2 μg总RNA为模板，利用随机引物进行反转录获得cDNA。
1.4 睾丸组织Ube2n和Trim36基因的定量PCR分析
参照普通牛的Ube2n（NM_001076258）、Trim36（XM_005890859）、内参基因GAPDH（NM_001034034）、18S RNA（NR_036642）序列，采用Primer Premier 5.0软件分别设计定量PCR引物（表1）。分别对上述4个基因进行PCR扩增，产物纯化后经10倍梯度稀释作为模板，进行荧光定量PCR扩增。利用定量PCR仪上的软件绘制标准曲线。表1 引物序列
目的基因引物（5′→3′） 产物长度（bp）Ube2nF：CCTTAGAGGGCATCAGATCCTCAG；R：AAGGTTCCAACCCACAGGTTAACA240Trim36F：TCTATGGCTCATTGGTAATAAGTAT；R：AAACCACCCAAGAAAGAGTATCT185GAPDHF：CGACTTCAACAGCGACACTCA；R：GGTCCAGGGACCTTACTCCTT16918S RNAF：CTGAGAAACGGCTACCACATC；R：CAGACTTGCCCTCCAATGG168
以反转录的牦牛和犏牛睾丸组织cDNA为模板，采用实时荧光定量PCR方法检测Ube2n、Trim36基因在睾丸中的相对表达量。25 μL PCR体系为：2×QuantiFast SYBR Green PCR Master Mix 12.5 μL、上游及下游引物各1 μL、模板cDNA 1 μL、RNase-free water 9.5 μL。PCR程序为：95 ℃预变性 5 min；95 ℃变性15 s，64 ℃退火15 s（Ube2n）或54 ℃退火20 s（Trim36），72 ℃延伸15 s，共40个循环。于65～95 ℃下制作溶解曲线。
1.5 数据统计
采用2-ΔΔCT法计算目的基因在睾丸中的mRNA水平。采用双内参GAPDH和18S RNA的几何平均数进行标准化，以牦牛睾丸的表达量为对照。试验数据以“平均值±标准误”表示，采用SPSS 18.0软件对荧光定量数据进行t检验。 2 结果与分析
2.1 Ube2n和Trim36基因表达的荧光定量PCR分析方法
本研究提取的睾丸RNA质量经核酸蛋白检测仪和琼脂糖凝胶电泳系统的检测分析，浓度和质量均符合要求。本试验建立了牦牛Ube2n和Trim36基因mRNA的定量PCR检测方法，采用双内参基因进行标准化。目的基因和内参基因扩增的特异性高（图1），扩增效率为98.6%～103.8%，标准曲线线性关系较好（R2约为0.99），符合所用仪器的定量及相应算法要求。
2.2 牦牛和犏牛睾丸组织Ube2n、Trim36基因mRNA水平的比较
对成年牦牛和雄性不育犏牛睾丸中Ube2n、Trim36基因mRNA水平的定量PCR检测显示，犏牛睾丸中Ube2n、Trim36基因的mRNA水平分别显著、极显著低于牦牛，其中Ube2n mRNA水平相差约2倍，而Trim36 mRNA水平相差10倍以上（图2）。
3 结论与讨论
蛋白质的泛素化是其在细胞中降解的关键，在调节各种细胞生物学过程（细胞周期、DNA损伤的修复、信号转导等）中发挥重要作用，涉及3种酶的参与以及多种修饰模式[8-9]。本研究在mRNA水平证实，2种参与泛素化的酶基因（Ube2n、Trim36）在犏牛睾丸中的表达均显著下降，提示犏牛睾丸中蛋白质的泛素化降解可能存在异常。牦牛和犏牛睾丸中Ube2n、Trim36基因mRNA的变化趋势与其蛋白质水平的变化趋势相同[6]（部分为待发表资料），进一步验证了参与泛素化的2种酶在犏牛睾丸中表达异常。
犏牛的杂种优势具有重要的应用价值，但其雄性不育在很大程度上制约了犏牛的高效利用。犏牛睾丸组织中无精子[7]，精子发生受阻很可能与减数分裂异常有关。犏牛睾丸中很多与生殖相关的基因表达下调[2-7]，但与其雄性不育的因果关系尚未明确。犏牛睾丸组织泛素化水平降低与其精子发生异常是否存在关联，需要进一步研究证实。笔者推测，由于犏牛睾丸中多数蛋白质的表达水平可能下降[2-7]，其泛素化水平的降低很可能是适应蛋白质水平改变的结果。Ube2n和Trim36 mRNA水平在犏牛睾丸中的显著下降或许不是犏牛雄性不育的关键原因，但其机制可能涉及睾丸精子发生过程中复杂的网络调控。精子发生过程中减数分裂异常的原因很多，如生殖隔离中减数分裂前期DNA双链断裂（DSB）不能修复、染色体联会或重组异常等[10]。这种DNA的修复或许直接导致蛋白质泛素化修饰相关酶的改变，已有研究表明，参与DNA双链断裂修复的蛋白质或DNA损伤可通过一些机制影响其他蛋白质的泛素化[11-12]。雄性不育犏牛睾丸组织Ube2n和Trim36 mRNA水平显著下降， 是其精子发生异常所涉及的基因网络调控的一部分。
参考文献：
[1]张旭静. 牦牛和普通牛种间杂种公牛睾丸的组织学观测与研究[J]. 畜牧兽医学报，2001，32（4）：314-318.
[2]屈旭光，李齐发，刘振山，等. 牦牛、犏牛睾丸组织中SYCP3基因mRNA表达水平研究[J]. 畜牧兽医学报，2008，39（8）：1132-1136.
[3]付 永，魏雅萍，吴克选，等. Real-time PCR检测黄牛、牦牛、犏牛睾丸组织中Boule、Dazl基因mRNA表达[J]. 生物技术通报，2012（10）：150-155.
[4]金 帅，郭 宪，包鹏甲，等. 牦牛和犏牛Dmrt7基因序列分析及其在睾丸组织中的表达水平[J]. 中国农业科学，2013，46（5）：1036-1043.
[5]李 贤，李齐发，赵兴波，等. 牦牛和犏牛Dmc1基因序列分析及睾丸组织转录水平研究[J]. 中国农业科学，2010，43（15）：3221-3229.
[6]付 伟，李彩霞，刘文静，等. 利用双向电泳-质谱技术鉴定牦牛和犏牛睾丸中的差异表达蛋白质[J]. 西南民族大学学报（自然科学版），2014，40（1）：11-15.
[7]Lou Y N，Liu W J，Wang C L，et al. Histological evaluation and Prdm9 expression level in the testis of sterile male cattle-yaks[J]. Livestock Science，2014，160：208-213.
[8]Komander D，Rape M. The ubiquitin code[J]. Annual Review of Biochemistry，2012，81：203-229.
[9]何 玲，张令强. 线性泛素化修饰研究进展[J]. 遗传，2015，37（9）：911-917.
[10]Li X C，Barringer B C，Barbash D A. The pachytene checkpoint and its relationship to evolutionary patterns of polyploidization and hybrid sterility[J]. Heredity，2009，102（1）：24-30.
[11]Shang Z F，Tan W，Liu X D，et al. DNA-PKcs negatively regulates cyclin B1 protein stability through facilitating its ubiquitination mediated by Cdh1-APC/C pathway[J]. International Journal of Biological Sciences，2015，11（9）：1026-1035.
[12]Jiang Z H，Dong X W，Shen Y C，et al. DNA damage regulates ARID1A stability via SCF ubiquitin ligase in gastric cancer cells[J]. European Review for Medical and Pharmacological Sciences，2015，19（17）：3194-3200.姚紹嫦，谭文明，蓝祖栽，等. 海南冬青组培快繁体系的建立[J]. 江苏农业科学，2017，45（1）：22-26.