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摘要 为阐明甜菜夜蛾Spodoptera exigua化学感受蛋白识别外源化合物的特性和作用机制，运用Western blotting法分析SexiCSP2蛋白在成虫各组织的表达谱，荧光竞争结合试验法测定SexiCSP2蛋白与25种外源配基的结合特性，运用分子对接、分子动力学、结合自由能计算等方法研究SexiCSP2与配基的结合模式。结果显示SexiCSP2在成虫接触和非接触性器官中均有表达，与己醛结合能力最强，解离常数为1.3 μmol/L;分子模拟结果显示SexiCSP2与己醛结合形成1个氢键，两者结合自由能为-32.94 kJ/mol，主要驱动力为范德华力，主要抑制力为非极性溶剂化能。这些结果说明SexiCSP2在甜菜夜蛾识别外源化合物中起重要作用，可以作为防控甜菜夜蛾的有效靶标。
关键词 甜菜夜蛾; 化学感受蛋白; Western blotting; 荧光竞争结合试验; 分子动力学
中图分类号： Q 966
文献标识码： A
DOI： 10.16688/j.zwbh.2020372
The binding specificity and mechanism of chemosensory protein SexiCSP2 in the beet armyworm， Spodoptera exigua
DENG Peiyuan， WANG Linqing， YUAN Hongzhe， LI Changkan*
（Zhengzhou Normal University， Research Centre of Biological Species Resources， Zhengzhou 450044， China）
Abstract
To determine the binding characteristics and mechanism of Spodoptera exigua chemosensory proteins （CSPs） in discriminating exogenous compounds， the expression profiles of SexiCSP2 in adult tissues were analyzed by Western blotting， the binding specificities of SexiCSP2 and 25 foreign ligands were tested through fluorescence competitive binding assay. Moreover， the binding pattern was studied by using molecular docking， molecular dynamics simulation and binding free energy calculation methods. The results showed that SexiCSP2 was expressed in both contact and non-contact organs. It had a strongest binding ability to hexanal with a dissociation constant of 13 μmol/L. Molecular simulation results showed that hexanal formed a hydrogen bond with SexiCSP2， and the binding free energy was -32.94 kJ/mol; the van der Wals was the main driving force， and the nonpolar solvation energy was the main resistance force. These data indicated that SexiCSP2 might play an important role in the process of discriminating exogenous compounds and could be used as an effective target for the prevention and control of S.exigua.
Key words
Spodoptera exigua; chemosensory protein; Western blotting; fluorescence competitive binding assay; molecular dynamics
昆蟲之间以及昆虫与外界环境之间联系主要靠化学通讯来完成，研究发现昆虫触角感受器中存在几类在感受外界化学信息过程中起关键作用的蛋白，如气味结合蛋白（odorant binding protein， OBP）[1-2]和化学感受蛋白（chemosensory protein， CSP）[3]等。它们与昆虫寻找寄主、交配产卵、躲避天敌等行为密切相关[4]。OBP主要结合和转运挥发性的化合物，CSP主要结合和转运非挥发性的化合物，与OBP相比，CSP的分布和功能更加多样化[5]，如烟芽夜蛾Heliothis virescens的CSP在足部有较高的表达量[6];东亚飞蝗Locusta migratoria的部分CSP在生殖器中特异表达[7];美洲大蠊Periplaneta americana的PameP10在新生足中的表达量是正常足的30倍，可能参与了足的再生[8];甜菜夜蛾SexiCSP3在雌虫卵巢中的表达量远高于其在雄虫精巢中的表达量，参与调控产卵行为[9];意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica的CSP5在卵中特异表达，影响了幼虫体壁的发育[10]等。尽管关于依据CSP时空表达分析其生理功能已有大量报道，但目前为止没有被广泛认同的假说，一般认为参与化合物的结合和释放是其主要功能之一[11]，如东亚飞蝗CSPⅡ与直链油酸酰胺特异结合[12]，甜菜夜蛾SexiCSP3能有效结合芳香族化合物[13]，甘蓝夜蛾Mamestra brassicae的MbraCSPA6与含12～18个碳原子的长链脂肪烃类化合物及其卤代物结合能力较强[14]，这些研究表明CSP参与了昆虫对外界化合物的感受和结合，但仍缺乏更深入的机理研究。 甜菜夜蛾是一种为害粮、棉、蔬菜等多种作物的多食性和间歇性暴发的重要农业害虫，特别是在高龄幼虫阶段大量取食叶片，剥食植物茎秆，对作物造成毁灭性的损害[15]，对其嗅觉相关蛋白功能的研究是探索有效防治方法的重要途径。研究发现SexiCSP2基因广泛分布于嗅觉组织和非嗅觉组织[9]，推测其可能有重要生理功能。本试验以其为研究对象，采用Western blotting方法检测其在蛋白水平的表达谱;并以1-NPN为荧光探针，利用纯化的重组SexiCSP2蛋白进行荧光竞争结合试验，参考Li等[16]和Qiao等[17]的方法，测定其与25种绿色植物挥发物[18]和虫害诱导挥发物[19]的结合能力;运用分子模拟分析SexiCSP2与气味分子间的结合模式和关键氨基酸;为阐明化学感受蛋白作用的分子机制提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 供试昆虫
在相对湿度为70%～80%，室温26℃，光周期L∥D=14 h∥10 h条件下，在郑州生物物种资源研究重点实验室以人工饲料[20]饲养甜菜夜蛾。成虫以5%的蜂蜜水补充营养。
1.2 主要试剂、材料和仪器
总RNA提取试剂盒、第一链cDNA合成试剂盒、限制性内切酶购自TaKaRa公司，pfu DNA聚合酶，T4连接酶和预染蛋白Marker购自Ferments公司，1-NPN和配基化合物购自Sigma公司，碱性磷酸酶（AP）标记的IgG及相关试剂购自Amersco公司，荧光光度计型号为Jasco FP-750。分子模拟试验在河南省涉鸟故障工程技术研究中心YASARA分子模拟平台完成。
1.3 引物设计和cDNA模板的制备
1.3.1 引物设计
依据甜菜夜蛾SexiCSP2成熟编码框序列（EF186794.1）设计引物，上游引物：5′-AACATATG-
CGGCCCGACGACTCCCACT-3′;下游引物：5′-GCGAATTCAATTCGGAACTAGAAGAACT-3′。引物前两位为保护碱基，3～8位分别为
关键词 甜菜夜蛾; 化学感受蛋白; Western blotting; 荧光竞争结合试验; 分子动力学
中图分类号： Q 966
文献标识码： A
DOI： 10.16688/j.zwbh.2020372
The binding specificity and mechanism of chemosensory protein SexiCSP2 in the beet armyworm， Spodoptera exigua
DENG Peiyuan， WANG Linqing， YUAN Hongzhe， LI Changkan*
（Zhengzhou Normal University， Research Centre of Biological Species Resources， Zhengzhou 450044， China）
Abstract
To determine the binding characteristics and mechanism of Spodoptera exigua chemosensory proteins （CSPs） in discriminating exogenous compounds， the expression profiles of SexiCSP2 in adult tissues were analyzed by Western blotting， the binding specificities of SexiCSP2 and 25 foreign ligands were tested through fluorescence competitive binding assay. Moreover， the binding pattern was studied by using molecular docking， molecular dynamics simulation and binding free energy calculation methods. The results showed that SexiCSP2 was expressed in both contact and non-contact organs. It had a strongest binding ability to hexanal with a dissociation constant of 13 μmol/L. Molecular simulation results showed that hexanal formed a hydrogen bond with SexiCSP2， and the binding free energy was -32.94 kJ/mol; the van der Wals was the main driving force， and the nonpolar solvation energy was the main resistance force. These data indicated that SexiCSP2 might play an important role in the process of discriminating exogenous compounds and could be used as an effective target for the prevention and control of S.exigua.
Key words
Spodoptera exigua; chemosensory protein; Western blotting; fluorescence competitive binding assay; molecular dynamics
昆蟲之间以及昆虫与外界环境之间联系主要靠化学通讯来完成，研究发现昆虫触角感受器中存在几类在感受外界化学信息过程中起关键作用的蛋白，如气味结合蛋白（odorant binding protein， OBP）[1-2]和化学感受蛋白（chemosensory protein， CSP）[3]等。它们与昆虫寻找寄主、交配产卵、躲避天敌等行为密切相关[4]。OBP主要结合和转运挥发性的化合物，CSP主要结合和转运非挥发性的化合物，与OBP相比，CSP的分布和功能更加多样化[5]，如烟芽夜蛾Heliothis virescens的CSP在足部有较高的表达量[6];东亚飞蝗Locusta migratoria的部分CSP在生殖器中特异表达[7];美洲大蠊Periplaneta americana的PameP10在新生足中的表达量是正常足的30倍，可能参与了足的再生[8];甜菜夜蛾SexiCSP3在雌虫卵巢中的表达量远高于其在雄虫精巢中的表达量，参与调控产卵行为[9];意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica的CSP5在卵中特异表达，影响了幼虫体壁的发育[10]等。尽管关于依据CSP时空表达分析其生理功能已有大量报道，但目前为止没有被广泛认同的假说，一般认为参与化合物的结合和释放是其主要功能之一[11]，如东亚飞蝗CSPⅡ与直链油酸酰胺特异结合[12]，甜菜夜蛾SexiCSP3能有效结合芳香族化合物[13]，甘蓝夜蛾Mamestra brassicae的MbraCSPA6与含12～18个碳原子的长链脂肪烃类化合物及其卤代物结合能力较强[14]，这些研究表明CSP参与了昆虫对外界化合物的感受和结合，但仍缺乏更深入的机理研究。 甜菜夜蛾是一种为害粮、棉、蔬菜等多种作物的多食性和间歇性暴发的重要农业害虫，特别是在高龄幼虫阶段大量取食叶片，剥食植物茎秆，对作物造成毁灭性的损害[15]，对其嗅觉相关蛋白功能的研究是探索有效防治方法的重要途径。研究发现SexiCSP2基因广泛分布于嗅觉组织和非嗅觉组织[9]，推测其可能有重要生理功能。本试验以其为研究对象，采用Western blotting方法检测其在蛋白水平的表达谱;并以1-NPN为荧光探针，利用纯化的重组SexiCSP2蛋白进行荧光竞争结合试验，参考Li等[16]和Qiao等[17]的方法，测定其与25种绿色植物挥发物[18]和虫害诱导挥发物[19]的结合能力;运用分子模拟分析SexiCSP2与气味分子间的结合模式和关键氨基酸;为阐明化学感受蛋白作用的分子机制提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 供试昆虫
在相对湿度为70%～80%，室温26℃，光周期L∥D=14 h∥10 h条件下，在郑州生物物种资源研究重点实验室以人工饲料[20]饲养甜菜夜蛾。成虫以5%的蜂蜜水补充营养。
1.2 主要试剂、材料和仪器
总RNA提取试剂盒、第一链cDNA合成试剂盒、限制性内切酶购自TaKaRa公司，pfu DNA聚合酶，T4连接酶和预染蛋白Marker购自Ferments公司，1-NPN和配基化合物购自Sigma公司，碱性磷酸酶（AP）标记的IgG及相关试剂购自Amersco公司，荧光光度计型号为Jasco FP-750。分子模拟试验在河南省涉鸟故障工程技术研究中心YASARA分子模拟平台完成。
1.3 引物设计和cDNA模板的制备
1.3.1 引物设计
依据甜菜夜蛾SexiCSP2成熟编码框序列（EF186794.1）设计引物，上游引物：5′-AACATATG-
CGGCCCGACGACTCCCACT-3′;下游引物：5′-GCGAATTCAATTCGGAACTAGAAGAACT-3′。引物前两位为保护碱基，3～8位分别为