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摘要：线虫乙酰胆碱酯酶(ACHE)以多种不同的分子型存在并由不同的基因所编码。本综述简述了线虫AChE的药理学特性、分子型以及相关ace基因的结构、分布和功能。
关键词：线虫；乙酰胆碱酯酶；分子型；ace基因
中图分类号Q 78：S 432，45
线虫依靠沿虫体体壁纵向排列的背肌带和腹肌带的收缩而获得蠕行的动力。在线虫的腹神经索和背神经索存在神经一肌肉突触，通过兴奋性神经递质乙酰胆碱(ACh)以调节肌肉活动。乙酰胆碱酯酶是生物神经传导中的一种关键性的酶，在胆碱能突触间，该酶降解乙酰胆碱，终止神经递质对突触后膜的兴奋作用，保证神经信号在生物体内的正常传递。当AChE受到有机磷类和氨基甲酸酯类药剂抑制时，ACh在突触内聚集，先引起突触后膜乙酰胆碱受体的高度兴奋，然后产生去极化作用，导致虫体麻痹。植物寄生线虫麻痹后，由于不能找到寄主和食物而死亡。动物寄生线虫如巴西日圆线虫(Nippostrongylus brasiliensis)等，AChE除了其正常的神经学功能外，它还是一种分泌性产物，但对于分泌性AChE的生理功能目前仍有争议。当AChE受到抑制同样将导致线虫麻痹，使动物寄生线虫从宿主体内排出。
1、线虫AChE的分子型(molecular forms)
过去曾长期认为线虫和大多数无脊椎动物、所有的脊椎动物一样均由单基因编码AChE并只有单一分子型，但通过对自由生活线虫秀丽小杆线虫(Caenorhabditis elegans)，动物寄生线虫如捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)、蛔虫(Ascarislumbricoides)等和植物寄生线虫如南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)等的研究表明，线虫的AChE以多种分子型存在。对其分子结构分析表明，这些形式的酶不具有其他种类动物中常见的、与许多AChE有关的胶原尾，而是球形的单体(G1)、二聚体(G2)和四聚体(G4)，并依据其溶解性又可分为两亲分子(amphiphilic)和非两亲分子(nonamphipilic)。这些分子型又组成了AChE的不同类型，并由多种基因所编码，其编码不同的动力学类型在底物的亲和性、对抑制剂的敏感性等性质方面均有明显不同。这些酶类在线虫体内量的多少和分布可能是影响抑制剂对线虫行为作用的重要因素，并发现许多种动物寄生线虫能通过侧器腺体活跃地分泌AChE。这些分泌性AChE与在神经一肌肉突触间的AChE有着明显的差异。
2、线虫AChE的药理学特性
氨基甲酸酯类和有机磷类杀线虫剂与AChE的结合方式类似于天然底物，首先形成一个复合体，然后AChE活性部位的丝氨酸残基被氨基甲酰酯化或磷酰化，这就造成了酶的被抑制。早期的研究发现有机磷类和氨基甲酸酯类杀线虫剂的一个共同特征是具有与AChE作用的可逆性。几种植物寄生线虫经有机磷和氨基甲酸酯抑制剂作用后可恢复活动。如燕麦真滑刃线虫(Aphelenchus avenae)经涕灭威作用72 h后再经过在蒸馏水中48 h的恢复，线虫AChE的活性恢复率高达98％，而经苯线磷作用后的恢复率仅约6％。秀丽小杆线虫经氨基甲酸酯类和有机磷类作用24 h后，线虫AChE的恢复迅速，其中涕灭威作用过的线虫经24 h的恢复期后，线虫的AChE活性几乎完全恢复，但经苯线磷抑制的线虫在24 h恢复期后，与未经药物作用的线虫相比，仅观察到约10％的AChE活性，但这样小量的AChE活性恢复已足以使线虫恢复正常活动。
经氨基甲酸酯类杀虫剂麻痹的线虫与未经药剂作用的线虫相比，前者仍具有较高的AChE活性。氨基甲酸酯类涕灭威抑制AChE活性的动力学试验证明，抑制表现出两个阶段，即约50％AChE活性丧失较快，而剩余的部分则被抑制得较慢。在经长达24 h的持续作用后，线虫的AChE可被完全抑制。基于以上现象的观察和采用去污剂皂甙所做的试验数据，Russell曾猜测AChE可能存在于两个室(compartment)内，并由脂膜分隔开，第1室可能存在于神经一肌肉突触，AChE可迅速失活，是与线虫行为相关的部分；第2室AChE的被抑制极为缓慢，可能与线虫行为无关。但后来认为，这是由于线虫中存在对抑制剂具有高度抗性的AChE类型所致。
3、线虫AChE的基因结构、功能和组织分布
近年来对多种线虫尤其是以秀丽小杆线虫为模式线虫对AChE的相关基因进行了克隆和测序，揭示了其结构、组织的分布并推测了其分别演绎的功能。发现线虫的乙酰胆碱酯酶由多种基因所编码。对秀丽小杆线虫的遗传分析认为编码AChE的有4种基因ace-1、ace-2、ace-3和ace-4，分别编码4种不同AChE类型。其基因结构见图1。在染色体X上的ace-1编码ACE-1，染色体工上的ace-2编码ACE-2，染色体Ⅱ上的ace-3编码ACE-3。缺失ace-1或ace-2的秀丽小杆线虫突变体在行动上仅有轻微的改变，而缺失ace-3的突变体则未观察到行为或发育异常。缺失ace-1和ace-2线虫运动上表现出严重的不协调，缺失ace-1、ace-2和ace-3的3个基因的突变体则致死。
3.1ACE-1
编码秀丽小杆线虫ACE-1的ace-1基因与编码人类以及电鳐(torpedo)的AChE基因具有42％的同源性，主要分布在线虫的体壁肌细胞。秀丽小杆线虫和Caenorhabditis briggsae的ACE-1是一个两亲分子四聚体，具有一疏水的非催化亚基，与脊椎动物的AChE催化亚基AChE(T)相类似，并在花生根结线虫(M.arenaria)和南方根结线虫中发现同样也有该亚基。最近作者克隆并推导的甘薯茎线虫(Ditylenchus destructor)乙酰胆碱酯酶ACE-1(待发表)与秀丽小杆线虫、南方根结线虫、胎生网尾线虫(Dictyocaulus viviparus)的ACE-1高度同源。这些ACE的C-末端序列均具有色氨酸两亲分子四聚体(WAT)区域，该区具富含脯氨酸结合区(PRAD)。与秀丽小杆线虫ACE-1基因序列中有8个保守芳香族氨基酸残基相比较，南方根结线虫、爪哇根结线虫和甘薯茎线虫只有7个保守的芳香族氨基酸。
采用绿色荧光蛋白(GFP)报告基因结构通过显微注射法证明了秀丽小杆线虫的ace-1表达的空间分布。观察到ace-1在所有的体壁肌细胞、咽肌细胞pm5和头部神经中枢的3对感觉神经元都有表达。咽肌细胞对取食非常重要。咽的汲动通过神经元M5受胆碱能支配的调节，并发现ace-1、 ace-2均缺失的突变体咽功能有缺陷。研究发现ace-1在南方根结线虫和爪哇根结线虫的大多数生长阶段都能表达，但在雌成虫则未能检测到。由于雌成虫在植物根部组织是不迁移的，秀丽小杆线虫缺失ace-1的突变体其咽部汲动功能并未受到影响。因此，ace-1的表达与否对根结线虫雌成虫的生存不是必需的。
3.2ACE-2
秀丽小杆线虫的ACE-2是一种结合有糖基磷酯酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol，GPI)结构的两亲分子二聚体，其C末端是疏水的，与脊椎动物ACHE(H)结构非常相似，都有一个GPI锚定位点并在锚定位点的上游含有一个半胱氨酸残基，参与链间二硫键的形成。
从南方根结线虫、胎生网尾线虫(Dictyocaulusviviparus)和甘薯茎线虫克隆的cDNA与秀丽小杆线虫的ace-2均具有高度的同源性。但与秀丽小杆线虫、南方根结线虫和胎生网尾线虫的ACE-2相比较，作者在甘薯茎线虫ACE-2的C末端未发现半胱氨酸残基。这是否意味着该酶活性的改变有待进一步研究。
采用GFP报道基因显微注射法表明ace-2与ace-1具有不同的表达部位：ace-2主要在头部的感觉神经细胞、pm5细胞以及肛门神经节和真皮细胞下的运动神经元得到表达。而且ace-2是秀丽小杆线虫贲门表达AChE的唯一基因。通过RT-PCR技术研究发现，ace-2在南方根结线虫的卵孵化前的一龄幼虫及孵化后的生长阶段包括雌、雄虫均能表达。由于ace-1在南方根结线虫雌成虫则未能检测到，因此推测ace-2可能与线虫的取食有关。
3.3ACE-3和ACE-4
秀丽小杆线虫的ace-3和ace-4两基因均位于染色体Ⅱ，其间有356个核苷由ace-4的终止密码子和ace-3的起始密码子分离开来。ACE-3与GPI结构相结合成两亲分子二聚体。ACE-1和ACE-2大约占线虫总胆碱酯酶活性的95％，ACE-3的活性约占5％。Northern印迹分析发现几乎检测不到ace-4 mRNA，但显示ace-3 mRNA的丰度较高。与电鳐的保守序列FGESAG相比较，秀丽小杆线虫ACE-3不同的是VGESAG，表明该酶可能具有较低的催化效率。作者发现甘薯茎线虫的ACE-3中该保守序列并未改变，与电鳐及秀丽小杆线虫ACE-3的保守序列EDCLY相比较，甘薯茎线虫的ACE-3该序列改变为ENCLY，即127位天冬氨酸转变为天冬酰胺(待发表)。秀丽小杆线虫的ACE-4包含活性位点丝氨酸残基的保守序列FGQSAG不同于其他ACE的FGESAG，即199位谷氨酸置换成了199位谷氨酰胺。ACE-4可能具有非催化活性功能。
秀丽小杆线虫的ACE-3不同于其他分子型就在于它对ACh具有较低的Km，并对抑制剂毒扁豆碱和氨基甲酸酯类杀线虫剂涕灭威具有高度抗性。这与根结线虫的ACE-C相类似，对有机磷类和氨基甲酸酯类杀线虫剂具有相当高的抗性。由于ACE-3在线虫的咽部肌细胞、头部神经元、肛门神经节均有表达，这样对于已建立取食点的线虫在较高浓度的杀线虫剂的存在下仍然能取食并持续存活，使得线虫难以防治。
4、展望
秀丽小杆线虫基因组的研究促进了线虫AChE基因的研究，其中包括了线虫AChE基因的克隆、表达以及结构和功能的研究。线虫存在多个AChE基因已逐步被人们所认识。但目前国内外对线虫AChE的研究还较少，对其基因调控、分子进化、发育和生物学意义还不清楚。随着分子生物学、分子遗传学和生物信息学等学科的发展，开展对植物寄生线虫AChE的研究将有助于深入了解线虫AChE的特性，为开发新的防治药剂、途径和方法提供新的理论依据。
关键词：线虫；乙酰胆碱酯酶；分子型；ace基因
中图分类号Q 78：S 432，45
线虫依靠沿虫体体壁纵向排列的背肌带和腹肌带的收缩而获得蠕行的动力。在线虫的腹神经索和背神经索存在神经一肌肉突触，通过兴奋性神经递质乙酰胆碱(ACh)以调节肌肉活动。乙酰胆碱酯酶是生物神经传导中的一种关键性的酶，在胆碱能突触间，该酶降解乙酰胆碱，终止神经递质对突触后膜的兴奋作用，保证神经信号在生物体内的正常传递。当AChE受到有机磷类和氨基甲酸酯类药剂抑制时，ACh在突触内聚集，先引起突触后膜乙酰胆碱受体的高度兴奋，然后产生去极化作用，导致虫体麻痹。植物寄生线虫麻痹后，由于不能找到寄主和食物而死亡。动物寄生线虫如巴西日圆线虫(Nippostrongylus brasiliensis)等，AChE除了其正常的神经学功能外，它还是一种分泌性产物，但对于分泌性AChE的生理功能目前仍有争议。当AChE受到抑制同样将导致线虫麻痹，使动物寄生线虫从宿主体内排出。
1、线虫AChE的分子型(molecular forms)
过去曾长期认为线虫和大多数无脊椎动物、所有的脊椎动物一样均由单基因编码AChE并只有单一分子型，但通过对自由生活线虫秀丽小杆线虫(Caenorhabditis elegans)，动物寄生线虫如捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)、蛔虫(Ascarislumbricoides)等和植物寄生线虫如南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)等的研究表明，线虫的AChE以多种分子型存在。对其分子结构分析表明，这些形式的酶不具有其他种类动物中常见的、与许多AChE有关的胶原尾，而是球形的单体(G1)、二聚体(G2)和四聚体(G4)，并依据其溶解性又可分为两亲分子(amphiphilic)和非两亲分子(nonamphipilic)。这些分子型又组成了AChE的不同类型，并由多种基因所编码，其编码不同的动力学类型在底物的亲和性、对抑制剂的敏感性等性质方面均有明显不同。这些酶类在线虫体内量的多少和分布可能是影响抑制剂对线虫行为作用的重要因素，并发现许多种动物寄生线虫能通过侧器腺体活跃地分泌AChE。这些分泌性AChE与在神经一肌肉突触间的AChE有着明显的差异。
2、线虫AChE的药理学特性
氨基甲酸酯类和有机磷类杀线虫剂与AChE的结合方式类似于天然底物，首先形成一个复合体，然后AChE活性部位的丝氨酸残基被氨基甲酰酯化或磷酰化，这就造成了酶的被抑制。早期的研究发现有机磷类和氨基甲酸酯类杀线虫剂的一个共同特征是具有与AChE作用的可逆性。几种植物寄生线虫经有机磷和氨基甲酸酯抑制剂作用后可恢复活动。如燕麦真滑刃线虫(Aphelenchus avenae)经涕灭威作用72 h后再经过在蒸馏水中48 h的恢复，线虫AChE的活性恢复率高达98％，而经苯线磷作用后的恢复率仅约6％。秀丽小杆线虫经氨基甲酸酯类和有机磷类作用24 h后，线虫AChE的恢复迅速，其中涕灭威作用过的线虫经24 h的恢复期后，线虫的AChE活性几乎完全恢复，但经苯线磷抑制的线虫在24 h恢复期后，与未经药物作用的线虫相比，仅观察到约10％的AChE活性，但这样小量的AChE活性恢复已足以使线虫恢复正常活动。
经氨基甲酸酯类杀虫剂麻痹的线虫与未经药剂作用的线虫相比，前者仍具有较高的AChE活性。氨基甲酸酯类涕灭威抑制AChE活性的动力学试验证明，抑制表现出两个阶段，即约50％AChE活性丧失较快，而剩余的部分则被抑制得较慢。在经长达24 h的持续作用后，线虫的AChE可被完全抑制。基于以上现象的观察和采用去污剂皂甙所做的试验数据，Russell曾猜测AChE可能存在于两个室(compartment)内，并由脂膜分隔开，第1室可能存在于神经一肌肉突触，AChE可迅速失活，是与线虫行为相关的部分；第2室AChE的被抑制极为缓慢，可能与线虫行为无关。但后来认为，这是由于线虫中存在对抑制剂具有高度抗性的AChE类型所致。
3、线虫AChE的基因结构、功能和组织分布
近年来对多种线虫尤其是以秀丽小杆线虫为模式线虫对AChE的相关基因进行了克隆和测序，揭示了其结构、组织的分布并推测了其分别演绎的功能。发现线虫的乙酰胆碱酯酶由多种基因所编码。对秀丽小杆线虫的遗传分析认为编码AChE的有4种基因ace-1、ace-2、ace-3和ace-4，分别编码4种不同AChE类型。其基因结构见图1。在染色体X上的ace-1编码ACE-1，染色体工上的ace-2编码ACE-2，染色体Ⅱ上的ace-3编码ACE-3。缺失ace-1或ace-2的秀丽小杆线虫突变体在行动上仅有轻微的改变，而缺失ace-3的突变体则未观察到行为或发育异常。缺失ace-1和ace-2线虫运动上表现出严重的不协调，缺失ace-1、ace-2和ace-3的3个基因的突变体则致死。
3.1ACE-1
编码秀丽小杆线虫ACE-1的ace-1基因与编码人类以及电鳐(torpedo)的AChE基因具有42％的同源性，主要分布在线虫的体壁肌细胞。秀丽小杆线虫和Caenorhabditis briggsae的ACE-1是一个两亲分子四聚体，具有一疏水的非催化亚基，与脊椎动物的AChE催化亚基AChE(T)相类似，并在花生根结线虫(M.arenaria)和南方根结线虫中发现同样也有该亚基。最近作者克隆并推导的甘薯茎线虫(Ditylenchus destructor)乙酰胆碱酯酶ACE-1(待发表)与秀丽小杆线虫、南方根结线虫、胎生网尾线虫(Dictyocaulus viviparus)的ACE-1高度同源。这些ACE的C-末端序列均具有色氨酸两亲分子四聚体(WAT)区域，该区具富含脯氨酸结合区(PRAD)。与秀丽小杆线虫ACE-1基因序列中有8个保守芳香族氨基酸残基相比较，南方根结线虫、爪哇根结线虫和甘薯茎线虫只有7个保守的芳香族氨基酸。
采用绿色荧光蛋白(GFP)报告基因结构通过显微注射法证明了秀丽小杆线虫的ace-1表达的空间分布。观察到ace-1在所有的体壁肌细胞、咽肌细胞pm5和头部神经中枢的3对感觉神经元都有表达。咽肌细胞对取食非常重要。咽的汲动通过神经元M5受胆碱能支配的调节，并发现ace-1、 ace-2均缺失的突变体咽功能有缺陷。研究发现ace-1在南方根结线虫和爪哇根结线虫的大多数生长阶段都能表达，但在雌成虫则未能检测到。由于雌成虫在植物根部组织是不迁移的，秀丽小杆线虫缺失ace-1的突变体其咽部汲动功能并未受到影响。因此，ace-1的表达与否对根结线虫雌成虫的生存不是必需的。
3.2ACE-2
秀丽小杆线虫的ACE-2是一种结合有糖基磷酯酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol，GPI)结构的两亲分子二聚体，其C末端是疏水的，与脊椎动物ACHE(H)结构非常相似，都有一个GPI锚定位点并在锚定位点的上游含有一个半胱氨酸残基，参与链间二硫键的形成。
从南方根结线虫、胎生网尾线虫(Dictyocaulusviviparus)和甘薯茎线虫克隆的cDNA与秀丽小杆线虫的ace-2均具有高度的同源性。但与秀丽小杆线虫、南方根结线虫和胎生网尾线虫的ACE-2相比较，作者在甘薯茎线虫ACE-2的C末端未发现半胱氨酸残基。这是否意味着该酶活性的改变有待进一步研究。
采用GFP报道基因显微注射法表明ace-2与ace-1具有不同的表达部位：ace-2主要在头部的感觉神经细胞、pm5细胞以及肛门神经节和真皮细胞下的运动神经元得到表达。而且ace-2是秀丽小杆线虫贲门表达AChE的唯一基因。通过RT-PCR技术研究发现，ace-2在南方根结线虫的卵孵化前的一龄幼虫及孵化后的生长阶段包括雌、雄虫均能表达。由于ace-1在南方根结线虫雌成虫则未能检测到，因此推测ace-2可能与线虫的取食有关。
3.3ACE-3和ACE-4
秀丽小杆线虫的ace-3和ace-4两基因均位于染色体Ⅱ，其间有356个核苷由ace-4的终止密码子和ace-3的起始密码子分离开来。ACE-3与GPI结构相结合成两亲分子二聚体。ACE-1和ACE-2大约占线虫总胆碱酯酶活性的95％，ACE-3的活性约占5％。Northern印迹分析发现几乎检测不到ace-4 mRNA，但显示ace-3 mRNA的丰度较高。与电鳐的保守序列FGESAG相比较，秀丽小杆线虫ACE-3不同的是VGESAG，表明该酶可能具有较低的催化效率。作者发现甘薯茎线虫的ACE-3中该保守序列并未改变，与电鳐及秀丽小杆线虫ACE-3的保守序列EDCLY相比较，甘薯茎线虫的ACE-3该序列改变为ENCLY，即127位天冬氨酸转变为天冬酰胺(待发表)。秀丽小杆线虫的ACE-4包含活性位点丝氨酸残基的保守序列FGQSAG不同于其他ACE的FGESAG，即199位谷氨酸置换成了199位谷氨酰胺。ACE-4可能具有非催化活性功能。
秀丽小杆线虫的ACE-3不同于其他分子型就在于它对ACh具有较低的Km，并对抑制剂毒扁豆碱和氨基甲酸酯类杀线虫剂涕灭威具有高度抗性。这与根结线虫的ACE-C相类似，对有机磷类和氨基甲酸酯类杀线虫剂具有相当高的抗性。由于ACE-3在线虫的咽部肌细胞、头部神经元、肛门神经节均有表达，这样对于已建立取食点的线虫在较高浓度的杀线虫剂的存在下仍然能取食并持续存活，使得线虫难以防治。
4、展望
秀丽小杆线虫基因组的研究促进了线虫AChE基因的研究，其中包括了线虫AChE基因的克隆、表达以及结构和功能的研究。线虫存在多个AChE基因已逐步被人们所认识。但目前国内外对线虫AChE的研究还较少，对其基因调控、分子进化、发育和生物学意义还不清楚。随着分子生物学、分子遗传学和生物信息学等学科的发展，开展对植物寄生线虫AChE的研究将有助于深入了解线虫AChE的特性，为开发新的防治药剂、途径和方法提供新的理论依据。