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摘要[目的]建立非对称场流分离检测鲍内脏多糖的方法。[方法]采用非对称场流分离系统与静态光散射、光电二极管阵列和示差折光检测器联用技术分离表征鲍内脏多糖。以0.05 mol/L NaNO3 [含0.02%（W/V）NaN3] 为流动相，研究横向流速和样品浓度对非对称场流分离多糖的影响，并利用动静态光散射测量鲍内脏多糖的分子特性（分子量、均方根旋转半径、分子构象、流体力学半径）。[结果]不同横向流速对多糖的分离表征有显著影响；一定范围内，不同多糖浓度对分离效果及分子特性结果无显著差异。鲍内脏多糖分子量为（25.40±1.78）kD，均方根旋转半径为（16.70±0.30）nm，流体力学半径为（143.23±15.49）nm，分子为无规则线团构象。[结论]非对称场流技术适用于鲍内脏多糖的分离检测。
关键词非对称场流；鲍内脏多糖；分离表征；动静态光散射
中图分类号S917文献标识码A文章编号0517-6611（2018）28-0164-03
Detection of Polysaccharide from Abalone Viscera by Asymmetrical Flow FieldFlow Fractionation
ZHU Xiaopei1，2，JIAN Wenjie2，HOU Mengran1 et al
（1. Fisheries College of Jimei University，Xiamen，Fujian 361021；2.Nutrition and Food Safety Research Office of Xiamen Medical College，Xiamen，Fujian 361021）
Abstract[Objective] To establish an asymmetric flow fieldflow fractionation （AF4） method for the detection of polysaccharide from abalone viscera （AV）. [Method]AF4 technique was used to isolate polysaccharide from AV coupled with static light scattering device， photodiode array and differential refractive index detector. The effect of varying the cross flow and sample concentration on AF4 had been studied where 0.05 mol/L NaNO3 and 0.02%（W/V） NaN3 aqueous solution as carrier phase. The molecular characteristics （weightaverage molar mass （Mw）， root mean square radius （RMS）， molecular conformation， hydrodynamic radius） of polysaccharide from AV were measured by dynamic and static light scattering. [Result]The different cross flow had a significant effect on the determination of polysaccharide separation. Within a certain range， there was no significant difference in the separation effect and molecular property results between different polysaccharide concentrations.The Mw， RMS and hydrodynamic radius of polysaccharide from AV were （25.40±1.78） kDa， （16.70 ±0.30） nm and （143.23±15.49） nm， respectively. And the molecular conformation was random coil. [Conclusion] The AF4 is suitable for the separation and detection of polysaccharide from abalone viscera.
Key wordsAsymmetrical flow fieldflow fractionation；Polysaccharide from abalone viscera；Separation and characterization；Dynamic and static light scattering
基金項目国家海洋局海洋公益性行业科研专项（201405016）；福建省高等学校新世纪优秀人才支持计划项目（20170008）；福建省自然科学基金项目（2017D0009）；福建省科技引导性项目（2016N0022）。
非对称场流分离技术（asymmetrical flow field flow fractionation，AF4）是用于颗粒分离及表征的技术[1]，是一种基于流动的分离方法，结合了色谱和场驱动技术的基本要素，样本在外加垂直于层流方向的场力作用下，不同尺寸的被分离物层流层与通道壁的距离不同，具有不同的淋洗速度而达到分离的目的[2]。AF4无需固定相和填充物，具有较低的压力和剪切力，有助于保护脆弱的团粒结构，减少大分子降解[3-4]，最大限度地保护样品的结构稳定性[5]，可快速高分辨率地分离1 nm～100 μm的样品。由于AF4技术分离条件温和且表征范围广，因此被广泛应用于牛血清蛋白[6]、透明质酸[7]、淀粉[8]、脂蛋白[9]和脂质体[10]等生物颗粒和生物分子的分离检测。在生物分析领域具有巨大的应用潜力[11]。 鲍内脏多糖是通过蛋白酶酶解和超滤技术从废弃的鲍鱼内脏中分离提取出来的一类大分子活性物质[12]。目前，多糖常用的检测方法主要有离子交换树脂和色谱分离法。在前期研究中已采用凝胶渗透色谱法（GPC）分离表征鲍内脏多糖，虽然具有良好的表征效果，但需要添加固定相和填充材料，容易发生剪切降解和柱子阻塞，且分离纯化时间长[13-14]，因此探究更加适用的分离表征技术是非常必要的。目前，鲜见AF4用于分离表征鲍内脏多糖的相关报道。
该研究采用AF4串联静态光散射（SLS）、光电二极管阵列检测器（PDA）、示差折光（RI）检测器对鲍内脏多糖进行分离及表征，在前期研究中已检测到其中多糖含量为51.75%，蛋白质含量为20.51%[14]。已有研究表明AF4最大影响因素为横向流速[15]，而多糖的分子结构复杂，具有一定的黏性，为了保证样品分离质量，该研究探究了横向流速和样品浓度对分离效果的影响，为AF4应用于多糖分离表征领域提供理论基础。
1材料與方法
1.1试剂与仪器
非对称场流分离系统（AF2000MT）、示差折光检测器（RI：PN3150）和光电二极管阵列检测器（PDA：SPD-20A）均购自Postnova公司；静态光散射检测器（SLS：1249-H2）和动态光散射检测器（DLS：434-DPN）购自WYATT公司。
1.2鲍内脏多糖的制备
参考项目组前期方法[14]，通过2次酶解、超滤联合制备鲍内脏酶解液，将所得酶解液经终浓度75%乙醇醇沉得鲍内脏多糖。
1.3鲍内脏多糖分离及表征检测
借鉴Jian等[16]检测方法，采用非对称场流分离系统串联RI、PDA和SLS检测器对样品进行分离表征，检测器顺序依次为PDA、SLS和RI。因检测器间串联通道产生的延迟体积，采用PSS64标准品在WYATT光散射软件中进行校正，以保证样品峰在3个检测器的出峰时间一致。PDA可通过紫外吸收峰判断样品是否含有蛋白组分及其含量。RI可分析每个组分的浓度。SLS可检测每个组分的分子量及分子构象。分离系统通过软件AF2000 Control进行控制，ASTRA 6.1软件进行数据的采集分析。
DLS对鲍内脏多糖进行粒度表征，将20 μL样品直接加入到DLS样品池中，温度设定为25 ℃，样品采集时间为5 s，每个样品采集点数为100[9]，通过Dynamics 7.5 软件进行数据采集及分析。
2结果与分析
2.1非对称场流系统横向流速的选择
横向流速的大小是影响AF4系统分离效率的主要因素[9]。图1分别是不同横向流速鲍内脏多糖AF4-RI、AF4-SLS和AF4-PDA分离图谱。流动相为0.05 mol/L NaNO3[含0.02%（W/V） NaN3]，鲍内脏多糖浓度为1 mg/mL，分离体系检测速度为0.5 mL/min，进样时间为4 min，进样体积量为20.3 μL，横向流速分别为3、5、6和7 mL/min，设空白对照组，进样品为流动相。由图1可知，空白对照组检测信号并无显著波动，无杂峰。在横向流速为3和5 mL/min时，RI和SLS的样品峰和空隙峰（不保留物质，如流动相溶液等）[17]的分离并不明显，样品在进样结束后就洗脱出来；当横向流速为7 mL/min时，样品峰与空隙峰分离完整，但峰扩宽现象加剧，而且样品峰高度明显变低（图1a、b）。横向流速过大，会使得颗粒更靠近累积壁面，与腔室分离膜相互作用加剧，从而引起样品洗脱延迟[18]。图1c表明PDA的峰型并未受横向流速变化的影响，但出峰时间会随流速增大略微后移。样品在280 nm处具有吸收峰，表明其含有蛋白质组分。当横向流速为6 mL/min时，样品峰与空隙峰能较好地分开，样品扩峰较小[19]，峰型完整。因此，AF4横向流速为6 mL/min时，多糖分离效果最佳。分子表征结果见表1，由表1可知，横向流速为3、5、6和7 mL/min时，多糖的Mw、均方根旋转半径（RMS radius）及均方根旋转半径对摩尔质量斜率（RMS plot slope）结果差异显著，说明多糖分子量及分子构象的计算结果受AF4系统分离效果的影响。
2.2鲍内脏多糖浓度影响
图2分别是不同进样浓度鲍内脏多糖AF4-RI、AF4-SLS和AF4-PDA分离图谱。进样浓度分别为1、2和3 mg/mL，进样体积为20.3 μL，横向流速为6 mL/min。从图2可以看出，空白对照组检测信号并无显著波动。在3种不同样品浓度条件下，样品峰型并没有显著变化，样品浓度为3 mg/mL时，样品峰和空隙峰间隔相对其他2个浓度显著增大。不同浓度的鲍内脏多糖分子表征结果见表2，由表2可知，3种不同浓度的多糖的Mw、RMS radius及RMS plot slope结果差异并不显著。
2.3鲍内脏多糖分子特性
由鲍内脏多糖AF4系统分离条件探究可知，横向流速6 mL/min、多糖浓度3 mg/mL时，峰型完整，分子特性结果误差小，因此选择该条件的测试结果为鲍内脏多糖的分子特征，分子量为（25.40±1.78）kD，均方根旋转半径为（16.70±0.30）nm，均方根旋转半径对摩尔质量斜率为0.51（表2）。与前期研究采用GPC-MALLS分析鲍内脏多糖分子量分布于14～60 kD、均方根旋转半径11.4～37.0 nm 相似[20]，说明AF4是一种潜在的鲍内脏多糖的分离表征方法。光散射技术可通过测定高分子的均方根旋转半径对摩尔质量斜率间接判断其高级构象。当斜率接近1时，高分子呈棒状；当斜率接近1/3 时，高分子呈球状，若斜率为0.5～0.6时，高分子为无规线团。鲍内脏多糖的斜率为0.51，为无规则线团结构。鲍鱼内脏多糖的流体力学半径分布见图3，由图3可见，粒径在30～3 000 nm均有分布，主要集中于60～200 nm，计算得到平均粒径为（143.23±15.49）nm。 3结论
通过非对称场流分离系统与静态光散射、光电二极管阵列和示差折光检测器联用技术分离表征鲍内脏多糖，发现其分子量为（25.40±1.78）kD，均方根旋转半径为（16.70±0.30）nm，流体力学半径为（143.23±15.49）nm，分子为无规则线团构象，与前期采用GPC-MALLS分离表征鲍内脏多糖结果相似[20]，样品处理与操作过程简便，分离条件更加温和且用时短。因此，AF4适用于鲍内脏多糖的分离检测。
参考文献
[1] KIM B，WOO S，PARK Y S，et al.Ionic strength effect on molecular structure of hyaluronic acid investigated by flow fieldflow fractionation and multiangle light scattering[J].Analytical and bioanalytical chemistry，2015，407（5）：1327-1334.
[2] 张学军.场流分离技术及应用研究[D].长春：吉林大学，2007.
[3] BOLINSSON H，LU Y，HALL S，et al.An alternative method for calibration of flow field flow fractionation channels for hydrodynamic radius determination：The nanoemulsion method（featuring multi angle light scattering）[J].Journal of chromatography A，2018，1533：155-163.
[4] TGEL I，RUNYON J R，GALINDO F G，et al.Analysis of polysaccharide and proteinaceous macromolecules in beer using asymmetrical flow fieldflow fractionation[J].Journal of the institute of brewing，2015，121（1）：44-48.
[5] 鄂云龙.非对称流场流分离技术联用质谱对蛋白分子的分离表征[D].北京：北京化工大学，2015.
[6] YOHANNES G，WIEDMER S K，ELOMAA M，et al.Thermal aggregation of bovine serum albumin studied by asymmetrical flow fieldflow fractionation[J].Anal Chim Acta，2010，675（2）：191-198.
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[9] 王静，张潇月，张竞文，等.基于场流分离技术分离表征血清中的脂蛋白[J].河北大学学报（自然科学版），2017，37（2）：128-133.
[10] RAMBALDI D C，ZATTONI A，RESCHIGLIAN P，et al.In vitro amyloid Aβ1-42 peptide aggregation monitoring by asymmetrical flow fieldflow fractionation with multiangle light scattering detection[J].Anal Bioanal Chem，2009，394（8）：2145-2149.
[11] 梁启慧，吴迪，邱百灵，等.非对称流场流分离技术的现状及发展趋势[J].色谱，2017，35（9）：918-926.
[12] ZHOU D Y，ZHU B W，QIAO L，et al.In vitro antioxidant activity of enzymatic hydrolysates prepared from abalone（Haliotis discus hannai Ino）viscera[J].Food and bioproducts processing，2012，90（2）：148-154.
[13] RODA B，ZATTONI A，RESCHIGLIAN P，et al.Fieldflow fractionation in bioanalysis：A review of recent trends[J].Analytica chimica acta，2009，635（2）：132-143.
[14] 王姣，魏好程，何传波，等.鲍内脏多糖的抗氧化活性[J].食品科学，2017，38（15）：115-121.
[15] 鄂云龙，全灿，金君素，等.基于非对称流场流分离技术的蛋白分离研究[J].北京化工大学学报（自然科学版），2015，42（2）：30-34.
[16] JIAN W J，WU H Y，WU L L，et al.Effect of molecular characteristics of Konjac glucomannan on gelling and rheological properties of Tilapia myofibrillar protein[J].Carbohydr Polym，2016，150：21-31.
[17] LOHRKE J，BRIEL A，MEDER K.Characterization of superparamagnetic iron oxide nanoparticles by asymmetrical flowfieldflowfractionation[J].Nanomedicine，2008，3（4）：437-452.
[18] LIU M K，LI P，GIDDINGS J C.Rapid protein separation and diffusion coefficient measurement by frit inlet flow fieldflow fractionation[J].Protein science，1993，3（9）：1520-1531.
[19] 劉攀攀，全灿，李红梅，等.非对称场流分离技术用于纳米颗粒的表征[J].分析化学，2013，41（7）：1063-1068.
[20] 王姣.鲍内脏多糖的分离纯化及抗氧化活性研究[D].厦门：集美大学，2016.
关键词非对称场流；鲍内脏多糖；分离表征；动静态光散射
中图分类号S917文献标识码A文章编号0517-6611（2018）28-0164-03
Detection of Polysaccharide from Abalone Viscera by Asymmetrical Flow FieldFlow Fractionation
ZHU Xiaopei1，2，JIAN Wenjie2，HOU Mengran1 et al
（1. Fisheries College of Jimei University，Xiamen，Fujian 361021；2.Nutrition and Food Safety Research Office of Xiamen Medical College，Xiamen，Fujian 361021）
Abstract[Objective] To establish an asymmetric flow fieldflow fractionation （AF4） method for the detection of polysaccharide from abalone viscera （AV）. [Method]AF4 technique was used to isolate polysaccharide from AV coupled with static light scattering device， photodiode array and differential refractive index detector. The effect of varying the cross flow and sample concentration on AF4 had been studied where 0.05 mol/L NaNO3 and 0.02%（W/V） NaN3 aqueous solution as carrier phase. The molecular characteristics （weightaverage molar mass （Mw）， root mean square radius （RMS）， molecular conformation， hydrodynamic radius） of polysaccharide from AV were measured by dynamic and static light scattering. [Result]The different cross flow had a significant effect on the determination of polysaccharide separation. Within a certain range， there was no significant difference in the separation effect and molecular property results between different polysaccharide concentrations.The Mw， RMS and hydrodynamic radius of polysaccharide from AV were （25.40±1.78） kDa， （16.70 ±0.30） nm and （143.23±15.49） nm， respectively. And the molecular conformation was random coil. [Conclusion] The AF4 is suitable for the separation and detection of polysaccharide from abalone viscera.
Key wordsAsymmetrical flow fieldflow fractionation；Polysaccharide from abalone viscera；Separation and characterization；Dynamic and static light scattering
基金項目国家海洋局海洋公益性行业科研专项（201405016）；福建省高等学校新世纪优秀人才支持计划项目（20170008）；福建省自然科学基金项目（2017D0009）；福建省科技引导性项目（2016N0022）。
非对称场流分离技术（asymmetrical flow field flow fractionation，AF4）是用于颗粒分离及表征的技术[1]，是一种基于流动的分离方法，结合了色谱和场驱动技术的基本要素，样本在外加垂直于层流方向的场力作用下，不同尺寸的被分离物层流层与通道壁的距离不同，具有不同的淋洗速度而达到分离的目的[2]。AF4无需固定相和填充物，具有较低的压力和剪切力，有助于保护脆弱的团粒结构，减少大分子降解[3-4]，最大限度地保护样品的结构稳定性[5]，可快速高分辨率地分离1 nm～100 μm的样品。由于AF4技术分离条件温和且表征范围广，因此被广泛应用于牛血清蛋白[6]、透明质酸[7]、淀粉[8]、脂蛋白[9]和脂质体[10]等生物颗粒和生物分子的分离检测。在生物分析领域具有巨大的应用潜力[11]。 鲍内脏多糖是通过蛋白酶酶解和超滤技术从废弃的鲍鱼内脏中分离提取出来的一类大分子活性物质[12]。目前，多糖常用的检测方法主要有离子交换树脂和色谱分离法。在前期研究中已采用凝胶渗透色谱法（GPC）分离表征鲍内脏多糖，虽然具有良好的表征效果，但需要添加固定相和填充材料，容易发生剪切降解和柱子阻塞，且分离纯化时间长[13-14]，因此探究更加适用的分离表征技术是非常必要的。目前，鲜见AF4用于分离表征鲍内脏多糖的相关报道。
该研究采用AF4串联静态光散射（SLS）、光电二极管阵列检测器（PDA）、示差折光（RI）检测器对鲍内脏多糖进行分离及表征，在前期研究中已检测到其中多糖含量为51.75%，蛋白质含量为20.51%[14]。已有研究表明AF4最大影响因素为横向流速[15]，而多糖的分子结构复杂，具有一定的黏性，为了保证样品分离质量，该研究探究了横向流速和样品浓度对分离效果的影响，为AF4应用于多糖分离表征领域提供理论基础。
1材料與方法
1.1试剂与仪器
非对称场流分离系统（AF2000MT）、示差折光检测器（RI：PN3150）和光电二极管阵列检测器（PDA：SPD-20A）均购自Postnova公司；静态光散射检测器（SLS：1249-H2）和动态光散射检测器（DLS：434-DPN）购自WYATT公司。
1.2鲍内脏多糖的制备
参考项目组前期方法[14]，通过2次酶解、超滤联合制备鲍内脏酶解液，将所得酶解液经终浓度75%乙醇醇沉得鲍内脏多糖。
1.3鲍内脏多糖分离及表征检测
借鉴Jian等[16]检测方法，采用非对称场流分离系统串联RI、PDA和SLS检测器对样品进行分离表征，检测器顺序依次为PDA、SLS和RI。因检测器间串联通道产生的延迟体积，采用PSS64标准品在WYATT光散射软件中进行校正，以保证样品峰在3个检测器的出峰时间一致。PDA可通过紫外吸收峰判断样品是否含有蛋白组分及其含量。RI可分析每个组分的浓度。SLS可检测每个组分的分子量及分子构象。分离系统通过软件AF2000 Control进行控制，ASTRA 6.1软件进行数据的采集分析。
DLS对鲍内脏多糖进行粒度表征，将20 μL样品直接加入到DLS样品池中，温度设定为25 ℃，样品采集时间为5 s，每个样品采集点数为100[9]，通过Dynamics 7.5 软件进行数据采集及分析。
2结果与分析
2.1非对称场流系统横向流速的选择
横向流速的大小是影响AF4系统分离效率的主要因素[9]。图1分别是不同横向流速鲍内脏多糖AF4-RI、AF4-SLS和AF4-PDA分离图谱。流动相为0.05 mol/L NaNO3[含0.02%（W/V） NaN3]，鲍内脏多糖浓度为1 mg/mL，分离体系检测速度为0.5 mL/min，进样时间为4 min，进样体积量为20.3 μL，横向流速分别为3、5、6和7 mL/min，设空白对照组，进样品为流动相。由图1可知，空白对照组检测信号并无显著波动，无杂峰。在横向流速为3和5 mL/min时，RI和SLS的样品峰和空隙峰（不保留物质，如流动相溶液等）[17]的分离并不明显，样品在进样结束后就洗脱出来；当横向流速为7 mL/min时，样品峰与空隙峰分离完整，但峰扩宽现象加剧，而且样品峰高度明显变低（图1a、b）。横向流速过大，会使得颗粒更靠近累积壁面，与腔室分离膜相互作用加剧，从而引起样品洗脱延迟[18]。图1c表明PDA的峰型并未受横向流速变化的影响，但出峰时间会随流速增大略微后移。样品在280 nm处具有吸收峰，表明其含有蛋白质组分。当横向流速为6 mL/min时，样品峰与空隙峰能较好地分开，样品扩峰较小[19]，峰型完整。因此，AF4横向流速为6 mL/min时，多糖分离效果最佳。分子表征结果见表1，由表1可知，横向流速为3、5、6和7 mL/min时，多糖的Mw、均方根旋转半径（RMS radius）及均方根旋转半径对摩尔质量斜率（RMS plot slope）结果差异显著，说明多糖分子量及分子构象的计算结果受AF4系统分离效果的影响。
2.2鲍内脏多糖浓度影响
图2分别是不同进样浓度鲍内脏多糖AF4-RI、AF4-SLS和AF4-PDA分离图谱。进样浓度分别为1、2和3 mg/mL，进样体积为20.3 μL，横向流速为6 mL/min。从图2可以看出，空白对照组检测信号并无显著波动。在3种不同样品浓度条件下，样品峰型并没有显著变化，样品浓度为3 mg/mL时，样品峰和空隙峰间隔相对其他2个浓度显著增大。不同浓度的鲍内脏多糖分子表征结果见表2，由表2可知，3种不同浓度的多糖的Mw、RMS radius及RMS plot slope结果差异并不显著。
2.3鲍内脏多糖分子特性
由鲍内脏多糖AF4系统分离条件探究可知，横向流速6 mL/min、多糖浓度3 mg/mL时，峰型完整，分子特性结果误差小，因此选择该条件的测试结果为鲍内脏多糖的分子特征，分子量为（25.40±1.78）kD，均方根旋转半径为（16.70±0.30）nm，均方根旋转半径对摩尔质量斜率为0.51（表2）。与前期研究采用GPC-MALLS分析鲍内脏多糖分子量分布于14～60 kD、均方根旋转半径11.4～37.0 nm 相似[20]，说明AF4是一种潜在的鲍内脏多糖的分离表征方法。光散射技术可通过测定高分子的均方根旋转半径对摩尔质量斜率间接判断其高级构象。当斜率接近1时，高分子呈棒状；当斜率接近1/3 时，高分子呈球状，若斜率为0.5～0.6时，高分子为无规线团。鲍内脏多糖的斜率为0.51，为无规则线团结构。鲍鱼内脏多糖的流体力学半径分布见图3，由图3可见，粒径在30～3 000 nm均有分布，主要集中于60～200 nm，计算得到平均粒径为（143.23±15.49）nm。 3结论
通过非对称场流分离系统与静态光散射、光电二极管阵列和示差折光检测器联用技术分离表征鲍内脏多糖，发现其分子量为（25.40±1.78）kD，均方根旋转半径为（16.70±0.30）nm，流体力学半径为（143.23±15.49）nm，分子为无规则线团构象，与前期采用GPC-MALLS分离表征鲍内脏多糖结果相似[20]，样品处理与操作过程简便，分离条件更加温和且用时短。因此，AF4适用于鲍内脏多糖的分离检测。
参考文献
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[4] TGEL I，RUNYON J R，GALINDO F G，et al.Analysis of polysaccharide and proteinaceous macromolecules in beer using asymmetrical flow fieldflow fractionation[J].Journal of the institute of brewing，2015，121（1）：44-48.
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