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摘要：目的 测定不同炮制时间和温度下苍耳子中绿原酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸的含量变化，确定苍耳子炒制的最佳工艺。方法 采用砂炒法，温度150～220 ℃，时间0.5～7 min，每一温度分别炒制浅黄、黄褐色2份炮制品，共得到16份炮制样品。采用超高液相色谱法同时测定绿原酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸含量。色谱柱：Acquity BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱；流速：0.25 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：327 nm。结果 炮制品中绿原酸和3，5二咖啡酰奎宁酸的含量以160 ℃、7 min最高，分别为2.498、2.004 mg/g。结论 综合炮制品的外观和绿原酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸的含量测定结果，确定砂炒苍耳子以160 ℃、7 min较好。
关键词：苍耳子；炮制；绿原酸；3，5-二咖啡酰奎宁酸；超高液相色谱法
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）04-0082-04
苍耳子是中医临床治疗鼻渊头痛的要药，在《神农本草经》中列为中品，原名葈耳实[1]。2010年版《中华人民共和国药典》收录的苍耳子来源为菊科植物苍耳Xanthium sibiricum Patr.的干燥成熟带总苞的果实。对该药材的炮制要求是：除去杂质后，照清炒法炒至黄褐色，去刺，筛净[2]。该炮制工艺在实际操作中存在一些不合理因素。由于未去刺的苍耳子生品非常容易粘连成团，难以分开，这种情况下清炒炮制会导致其受热不均匀，出现一部分夹生、另一部分焦糊的现象；另外，炒制后苍耳子质地变松脆，易出现刺残存率高、种子易破裂等现象，最终影响药材质量。因此有必要对其炮制方法进行适当改进。
现代药理研究表明，苍耳子中含有多种酚酸类化合物，是主要的活性成分，具有抗炎和镇痛等药理作用[3]。前期研究表明，苍耳子酚酸类成分中含量较高的为绿原酸和3，5-二咖啡酰奎宁酸[4]。本试验采用去刺后砂炒法炮制苍耳子，超高液相色谱法（UPLC）测定绿原酸和3，5-二咖啡酰奎宁酸含量，通过比较不同炒制时间和温度对苍耳子中2种酚酸含量的影响，确定其最佳炮制条件，为苍耳子炮制工艺和机理研究提供依据。
1 仪器与试药
Waters超高效液相色谱仪（Waters Acquity H-Class UPLC，美国Waters公司），包括四元梯度泵、自动进样器、柱温箱、PDA检测器以及Empower 2工作站等；KQ3200DB型超声清洗器（江苏昆山超声仪器有限公司）；XFB-200型高速中药粉碎机（吉首市中州制药机械厂）；BP211D型电子天平（德国Sartorius公司）；电子万用炉（2 kW/220 V）；不锈钢炒锅、锅铲、20目铁筛、温度计、计时器等。
绿原酸（纯度99.39%，批号110753-200413），购自中国食品药品检定研究院；3，5-二咖啡奎宁酸（批号12101101），购自四川成都曼斯特化工有限公司，经1H-NMR、13C-NMR、MS、IR和UV等光谱检测确认其结构，按归一化法测得其纯度为99.20%。苍耳子产地为河南省，经本文通讯作者鉴定为菊科植物苍耳Xanthium sibiricum Patr.的干燥成熟带总苞果实。色谱纯乙腈（DIKMA公司）；甲醇、磷酸等试剂均为分析纯；蒸馏水（屈臣氏公司）；0.22 μm有机针孔滤膜（安捷伦科技有限公司）。
2 方法与结果
2.1 苍耳子炮制品制备
生苍耳子炮制前机械去刺。按2010年版《中华人民共和国药典》（一部）附录Ⅱ D项下砂炒法，取药材8倍量砂置锅内预热，武火加热至砂子滑利状态，测定离锅底1 cm左右处的温度，设定为炒制温度[5]，然后再投入苍耳子，每份50 g，共计16份，秒表计时。以炮制成品的颜色程度来决定炮制时间，每个时间点分别炒制浅黄色和黄褐色的炮制品各1份。当苍耳子炒制规定时间和颜色时出锅，立即过筛，放凉，得到不同时间和温度条件下的炮制品。将炮制好的16份苍耳子和生苍耳子粉碎，过20目筛，备用。试验共进行2次。
2.2 供试品溶液的制备
分别取按预定炮制条件制备好的苍耳子各样品粉末约0.3 g，精密称定，置于10 mL棕色量瓶内，用甲醇定容，超声提取（150 W，40 Hz）30 min，放冷，加甲醇补足损失容量，摇匀，再次静置，临用前用0.2 μm滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。
2.3 对照品溶液的制备
精密称取绿原酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸对照品适量，置10 mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液；分别取对照品储备液适量，置另一10 mL棕色量瓶混合、定容，得质量浓度分别为0.124、0.106 mg/mL的绿原酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸混合对照品溶液。
2.4 方法学考察
2.4.1 色谱条件及系统适用试验 Waters Acquity BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm） 色谱柱；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）；梯度洗脱程序：0～2.5 min，3.0%～10.0%A；2.5～8 min，10.0%～15.0%A；8.0～8.5 min，15.0%～20.0%A；8.5～14 min，20.0%～25.0%A；14～17 min，25.0%～35.0%A；17～20 min， 35.0%～50.0%A；流速为0.25 mL/min；检测波长：327 nm；柱温：30 ℃；进样量：2.0 μL。理论塔板数按绿原酸计大于20 000，按3，5-二咖啡酰奎宁酸计大于15 000，2个活性成分与相邻峰之间分离度大于1.5，对称因子在0.95～1.05之间[4，6]。色谱图见图1。 2.4.2 标准曲线的绘制 精密吸取“2.3”项下绿原酸和3，5-二咖啡酰奎宁酸对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μL，自动进样，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，混合对照品进样量为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。绿原酸的线性方程为Y=12 115 854.3X-122 319.2，r=0.999 9；3，5-二咖啡酰奎宁酸的线性方程为Y=1 302 394.7X+1 068 142.0，r=0.999 9。2种成分分别在0.124～0.620 μg和0.106～0.530 μg之间线性关系良好。
2.4.3 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液2.0 μL，重复进样6次，按“2.4.1”项下色谱条件测定，记录峰面积并计算，绿原酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸的峰面积RSD分别为0.43%、0.48%，表明仪器精密度良好。
2.4.4 稳定性试验 精密吸取S-2样品溶液2.0 μL，分别在溶液放置的0、2、4、8、16、24 h进样，测定峰面积并计算，结果绿原酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸的RSD分别为1.10%、1.43%，表明样品在24 h内稳定。
2.4.5 重复性试验 取S-6样品粉末，按“2.2”项下方法平行制备供试品溶液6份，按“2.4.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算，结果绿原酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸的RSD分别为0.84%、1.31%，表明重复性良好。
2.4.6 加样回收率试验 取已知含量的S-3样品（绿原酸和3，5-二咖啡酰奎宁酸含量分别为2.647、2.645 mg/g）粉末9份，每份约0.1 g，精密称定，置于10.0 mL具塞量瓶中，分别按样品含量的50%、100%、150%加入绿原酸和3，5-二咖啡酰奎宁酸对照品溶液，各3份，用甲醇定容，按“2.2”项下方法平行制备供试品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算平均回收率和RSD。结果见表1、表2。
2.5 样品含量测定
分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液2 μL，按“2.4.1”项下色谱条件进样，记录峰面积，计算2种成分含量。结果表明，炒制后绿原酸和3，5-二咖啡酰奎宁酸均较生品有所下降；随着炮制温度的增加，2种成分的总含量下降趋势越明显；但同一炮制温度下，炒制时间与成分含量降低未呈现明显相关性，推测可能炒制时间稍长、炮制程度加深，可以促进有效成分的溶出。依据含量测定结果，结合2010年版《中华人民共和国药典》（一部）苍耳子“表面黄褐色”，确定苍耳子的最佳工艺为160 ℃、7 min。见表3。
3 验证试验
为了对本试验工艺进行验证，另取同批生苍耳子3份，每份50 g，按照最佳炮制工艺即160 ℃、7 min炒制，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件测定绿原酸和3，5-二咖啡酰奎宁酸含量，结果3份样品的绿原酸和3，5-二咖啡酰奎宁酸的 总含量分别为4.659、4.343、4.836 mg/g。结果表明，试验建立的炮制工艺稳定、重复性较好，有效成分的含量损失较小，可作为苍耳子炮制工艺的参考。
4 讨论
苍耳子机械去刺方法简单、高效，去刺率较高[7]，且去刺后大大方便了包装、运输和炮制等工序，因而目前市售的生品苍耳子多为去刺后的产品。鉴于上述情况，本试验考虑对其炮制工艺适当改进，对于去刺后的苍耳子，以砂炒法进行炮制。由于砂传热均匀，即使有少量的残刺，也可接触到种子表面，使炒制的苍耳子颜色均匀，几乎无破裂现象。炒制的时间和温度不同，对药材的内在质量影响也不同，本试验着重考察了这2个因素对有效成分含量的影响。
UPLC具有分析时间快、灵敏度高、重复性好等优点，在中药质量控制和指纹图谱建立等研究中的应用非常广泛。本试验以苍耳子中2种含量较高的酚酸成分为指标，判断炮制品的质量，优选炮制工艺。在建立色谱条件时，试验考察了甲醇-水、甲醇-0.1%-磷酸水、乙腈-水和乙腈-0.1%-磷酸水4种流动相系统，最终确定乙腈-0.1%磷酸水溶液进行梯度洗脱；2种酚酸均在327 nm处有最大吸收，故含量测定时采用波长为327 nm；试验还对流速、柱温、色谱柱类型等相关条件进行了考察优化，最终确定了文中所述色谱条件。
参考文献：
[1] 王筠默.神农本草经校正[M].长春：吉林科学技术出版社，1988：344.
[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：151.
[3] 赵杰.苍耳子的药理作用与临床应用[J].中国现代药物应用，2010， 4（6）：96-97.
[4] 洪燕，韩燕全，夏伦祝，等.UPLC法测定不同产地苍耳子9种酚酸类成分的含量[J].中国药学杂志，2013，48（13）：1109-1112.
[5] 韩燕全，洪燕，高家荣，等.基于UPLC特征指纹图谱和指标成分定量测定研究炮姜的炮制工艺[J].中草药，2013，44（1）：42-46.
[6] 杨柳，苏芝军，许舜军，等.UPLC法同时测定苍耳子中4种酚酸类成分的含量[J].药学学报，2010，45（12）：1537.
[7] 曹丽萍，臧志和，廖洪利，等.苍耳子毒性成分及炮制工艺研究进展[J].中国医药导报，2008，5（8）：22-23.
（收稿日期：2013-09-25，编辑：陈静）
关键词：苍耳子；炮制；绿原酸；3，5-二咖啡酰奎宁酸；超高液相色谱法
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）04-0082-04
苍耳子是中医临床治疗鼻渊头痛的要药，在《神农本草经》中列为中品，原名葈耳实[1]。2010年版《中华人民共和国药典》收录的苍耳子来源为菊科植物苍耳Xanthium sibiricum Patr.的干燥成熟带总苞的果实。对该药材的炮制要求是：除去杂质后，照清炒法炒至黄褐色，去刺，筛净[2]。该炮制工艺在实际操作中存在一些不合理因素。由于未去刺的苍耳子生品非常容易粘连成团，难以分开，这种情况下清炒炮制会导致其受热不均匀，出现一部分夹生、另一部分焦糊的现象；另外，炒制后苍耳子质地变松脆，易出现刺残存率高、种子易破裂等现象，最终影响药材质量。因此有必要对其炮制方法进行适当改进。
现代药理研究表明，苍耳子中含有多种酚酸类化合物，是主要的活性成分，具有抗炎和镇痛等药理作用[3]。前期研究表明，苍耳子酚酸类成分中含量较高的为绿原酸和3，5-二咖啡酰奎宁酸[4]。本试验采用去刺后砂炒法炮制苍耳子，超高液相色谱法（UPLC）测定绿原酸和3，5-二咖啡酰奎宁酸含量，通过比较不同炒制时间和温度对苍耳子中2种酚酸含量的影响，确定其最佳炮制条件，为苍耳子炮制工艺和机理研究提供依据。
1 仪器与试药
Waters超高效液相色谱仪（Waters Acquity H-Class UPLC，美国Waters公司），包括四元梯度泵、自动进样器、柱温箱、PDA检测器以及Empower 2工作站等；KQ3200DB型超声清洗器（江苏昆山超声仪器有限公司）；XFB-200型高速中药粉碎机（吉首市中州制药机械厂）；BP211D型电子天平（德国Sartorius公司）；电子万用炉（2 kW/220 V）；不锈钢炒锅、锅铲、20目铁筛、温度计、计时器等。
绿原酸（纯度99.39%，批号110753-200413），购自中国食品药品检定研究院；3，5-二咖啡奎宁酸（批号12101101），购自四川成都曼斯特化工有限公司，经1H-NMR、13C-NMR、MS、IR和UV等光谱检测确认其结构，按归一化法测得其纯度为99.20%。苍耳子产地为河南省，经本文通讯作者鉴定为菊科植物苍耳Xanthium sibiricum Patr.的干燥成熟带总苞果实。色谱纯乙腈（DIKMA公司）；甲醇、磷酸等试剂均为分析纯；蒸馏水（屈臣氏公司）；0.22 μm有机针孔滤膜（安捷伦科技有限公司）。
2 方法与结果
2.1 苍耳子炮制品制备
生苍耳子炮制前机械去刺。按2010年版《中华人民共和国药典》（一部）附录Ⅱ D项下砂炒法，取药材8倍量砂置锅内预热，武火加热至砂子滑利状态，测定离锅底1 cm左右处的温度，设定为炒制温度[5]，然后再投入苍耳子，每份50 g，共计16份，秒表计时。以炮制成品的颜色程度来决定炮制时间，每个时间点分别炒制浅黄色和黄褐色的炮制品各1份。当苍耳子炒制规定时间和颜色时出锅，立即过筛，放凉，得到不同时间和温度条件下的炮制品。将炮制好的16份苍耳子和生苍耳子粉碎，过20目筛，备用。试验共进行2次。
2.2 供试品溶液的制备
分别取按预定炮制条件制备好的苍耳子各样品粉末约0.3 g，精密称定，置于10 mL棕色量瓶内，用甲醇定容，超声提取（150 W，40 Hz）30 min，放冷，加甲醇补足损失容量，摇匀，再次静置，临用前用0.2 μm滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。
2.3 对照品溶液的制备
精密称取绿原酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸对照品适量，置10 mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液；分别取对照品储备液适量，置另一10 mL棕色量瓶混合、定容，得质量浓度分别为0.124、0.106 mg/mL的绿原酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸混合对照品溶液。
2.4 方法学考察
2.4.1 色谱条件及系统适用试验 Waters Acquity BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm） 色谱柱；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）；梯度洗脱程序：0～2.5 min，3.0%～10.0%A；2.5～8 min，10.0%～15.0%A；8.0～8.5 min，15.0%～20.0%A；8.5～14 min，20.0%～25.0%A；14～17 min，25.0%～35.0%A；17～20 min， 35.0%～50.0%A；流速为0.25 mL/min；检测波长：327 nm；柱温：30 ℃；进样量：2.0 μL。理论塔板数按绿原酸计大于20 000，按3，5-二咖啡酰奎宁酸计大于15 000，2个活性成分与相邻峰之间分离度大于1.5，对称因子在0.95～1.05之间[4，6]。色谱图见图1。 2.4.2 标准曲线的绘制 精密吸取“2.3”项下绿原酸和3，5-二咖啡酰奎宁酸对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μL，自动进样，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，混合对照品进样量为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。绿原酸的线性方程为Y=12 115 854.3X-122 319.2，r=0.999 9；3，5-二咖啡酰奎宁酸的线性方程为Y=1 302 394.7X+1 068 142.0，r=0.999 9。2种成分分别在0.124～0.620 μg和0.106～0.530 μg之间线性关系良好。
2.4.3 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液2.0 μL，重复进样6次，按“2.4.1”项下色谱条件测定，记录峰面积并计算，绿原酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸的峰面积RSD分别为0.43%、0.48%，表明仪器精密度良好。
2.4.4 稳定性试验 精密吸取S-2样品溶液2.0 μL，分别在溶液放置的0、2、4、8、16、24 h进样，测定峰面积并计算，结果绿原酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸的RSD分别为1.10%、1.43%，表明样品在24 h内稳定。
2.4.5 重复性试验 取S-6样品粉末，按“2.2”项下方法平行制备供试品溶液6份，按“2.4.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算，结果绿原酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸的RSD分别为0.84%、1.31%，表明重复性良好。
2.4.6 加样回收率试验 取已知含量的S-3样品（绿原酸和3，5-二咖啡酰奎宁酸含量分别为2.647、2.645 mg/g）粉末9份，每份约0.1 g，精密称定，置于10.0 mL具塞量瓶中，分别按样品含量的50%、100%、150%加入绿原酸和3，5-二咖啡酰奎宁酸对照品溶液，各3份，用甲醇定容，按“2.2”项下方法平行制备供试品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算平均回收率和RSD。结果见表1、表2。
2.5 样品含量测定
分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液2 μL，按“2.4.1”项下色谱条件进样，记录峰面积，计算2种成分含量。结果表明，炒制后绿原酸和3，5-二咖啡酰奎宁酸均较生品有所下降；随着炮制温度的增加，2种成分的总含量下降趋势越明显；但同一炮制温度下，炒制时间与成分含量降低未呈现明显相关性，推测可能炒制时间稍长、炮制程度加深，可以促进有效成分的溶出。依据含量测定结果，结合2010年版《中华人民共和国药典》（一部）苍耳子“表面黄褐色”，确定苍耳子的最佳工艺为160 ℃、7 min。见表3。
3 验证试验
为了对本试验工艺进行验证，另取同批生苍耳子3份，每份50 g，按照最佳炮制工艺即160 ℃、7 min炒制，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件测定绿原酸和3，5-二咖啡酰奎宁酸含量，结果3份样品的绿原酸和3，5-二咖啡酰奎宁酸的 总含量分别为4.659、4.343、4.836 mg/g。结果表明，试验建立的炮制工艺稳定、重复性较好，有效成分的含量损失较小，可作为苍耳子炮制工艺的参考。
4 讨论
苍耳子机械去刺方法简单、高效，去刺率较高[7]，且去刺后大大方便了包装、运输和炮制等工序，因而目前市售的生品苍耳子多为去刺后的产品。鉴于上述情况，本试验考虑对其炮制工艺适当改进，对于去刺后的苍耳子，以砂炒法进行炮制。由于砂传热均匀，即使有少量的残刺，也可接触到种子表面，使炒制的苍耳子颜色均匀，几乎无破裂现象。炒制的时间和温度不同，对药材的内在质量影响也不同，本试验着重考察了这2个因素对有效成分含量的影响。
UPLC具有分析时间快、灵敏度高、重复性好等优点，在中药质量控制和指纹图谱建立等研究中的应用非常广泛。本试验以苍耳子中2种含量较高的酚酸成分为指标，判断炮制品的质量，优选炮制工艺。在建立色谱条件时，试验考察了甲醇-水、甲醇-0.1%-磷酸水、乙腈-水和乙腈-0.1%-磷酸水4种流动相系统，最终确定乙腈-0.1%磷酸水溶液进行梯度洗脱；2种酚酸均在327 nm处有最大吸收，故含量测定时采用波长为327 nm；试验还对流速、柱温、色谱柱类型等相关条件进行了考察优化，最终确定了文中所述色谱条件。
参考文献：
[1] 王筠默.神农本草经校正[M].长春：吉林科学技术出版社，1988：344.
[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：151.
[3] 赵杰.苍耳子的药理作用与临床应用[J].中国现代药物应用，2010， 4（6）：96-97.
[4] 洪燕，韩燕全，夏伦祝，等.UPLC法测定不同产地苍耳子9种酚酸类成分的含量[J].中国药学杂志，2013，48（13）：1109-1112.
[5] 韩燕全，洪燕，高家荣，等.基于UPLC特征指纹图谱和指标成分定量测定研究炮姜的炮制工艺[J].中草药，2013，44（1）：42-46.
[6] 杨柳，苏芝军，许舜军，等.UPLC法同时测定苍耳子中4种酚酸类成分的含量[J].药学学报，2010，45（12）：1537.
[7] 曹丽萍，臧志和，廖洪利，等.苍耳子毒性成分及炮制工艺研究进展[J].中国医药导报，2008，5（8）：22-23.
（收稿日期：2013-09-25，编辑：陈静）