【摘 要】
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目的:克隆人黑色素瘤相关抗原MAGE-A3基因,构建真核表达载体,检测、鉴定其在细胞中的表达。方法:MAGE-A3基因进行PCR扩增,凝胶回收PCR产物片段并连接至pMD18-T载体。测序后将
【机 构】
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广州市第一人民医院耳鼻咽喉科,广州医学院实验医学研究中心,美国哥伦比亚大学医学院病理与细胞生物系,
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目的:克隆人黑色素瘤相关抗原MAGE-A3基因,构建真核表达载体,检测、鉴定其在细胞中的表达。方法:MAGE-A3基因进行PCR扩增,凝胶回收PCR产物片段并连接至pMD18-T载体。测序后将MAGE-A3基因片段亚克隆至真核表达载体,构建成pIRES2-EGFP/MAGE-A3重组质粒经脂质体转染至293T细胞株后,荧光定量PCR、Western-blotting法鉴定MAGE-A3基因的表达。结果:MAGE-A3基因正确克隆在pIRES2-EGFP/MAGE-A3,测序结果与GenBank公布的MAGE-A3序列一致。转染293T细胞后能检测到MAGE-A3基因和蛋白的表达。结论:成功构建pIRES2-EGFP/MAGE-A3真核表达质粒,并能在293T细胞中有效表达MAGE-A3蛋白,奠定了其作为DNA疫苗应用的基础。
OBJECTIVE: To clone MAGE-A3 gene of human melanoma-associated antigen and construct eukaryotic expression vector to detect and identify its expression in cells. Methods: The MAGE-A3 gene was amplified by PCR. The PCR product fragments were recovered by gel and ligated into pMD18-T vector. After sequencing, the MAGE-A3 gene fragment was subcloned into the eukaryotic expression vector and the recombinant plasmid pIRES2-EGFP / MAGE-A3 was transfected into 293T cell line by lipofectamine 2000. The expression of MAGE- A3 gene expression. Results: The MAGE-A3 gene was correctly cloned in pIRES2-EGFP / MAGE-A3 and the sequencing result was consistent with the MAGE-A3 sequence published in GenBank. The expression of MAGE-A3 gene and protein was detected after 293T cells were transfected. CONCLUSION: The eukaryotic expression plasmid pIRES2-EGFP / MAGE-A3 was successfully constructed and efficiently expressed MAGE-A3 protein in 293T cells, which laid the foundation for its application as a DNA vaccine.
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