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摘 要 目的：建立健腰密骨片中丹酚酸B 的质量控制方法。方法：通过条件摸索，建立复方健腰密骨片中丹酚酸B薄层色谱定性鉴别方法和高效液相色谱定量检测方法。结果：制剂中丹酚酸B在薄层层析板上显示一清晰斑点、且重现性好、专属性强、阴性对照无干扰。HPLC测定显示丹酚酸B在0.191～15.291 mg范围内呈良好线性关系，回归方程为Y=1 190.30X-253.63，r=0.999 9；平均加样回收率及RSD分别为96.72%和1.46%。 结论：新建的检测方法简便、快速、准确，重复性好，可作为健腰密骨片中丹酚酸B的质量控制方法，可以更好地保证制剂的整体质量，具有很强的实用性。
关键词 健腰密骨片 丹酚酸B 薄层色谱鉴别 高效液相色谱
中图分类号：R927.2； R286 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2021）13-0073-04
Establishment of a quality control method for the determination of salvianolic acid B in Jianyao Migu tablets
ZHAO Xiaoling， SHANG Xiaohui， ZHAN Changsen
（Shanghai Hutchison Pharmaceuticals， Shanghai 201401， China）
ABSTRACT Objective： To establish a quality control method of salvianolic acid B in Jianyao Migu tablets. Methods： A thin-layer chromatography （TLC） method for qualitative identification and an HPLC method for the quantitative determination of salvianolic acid B were established by condition tests. Results： Salvianolic acid B in the preparation showed a clear spot on TLC， which was reproducible and specific without the interference of negative control. The calibration curve of salvianolic acid B by HPLC was linear in the range of 0.191-15.291 μg and regression equation was Y=1 190.30X-253.63， r=0.999 9. The average recovery ratio was 96.72% and the relative standard deviation was 1.46%. Conclusion： The established new methods are simple， rapid， accurate and reproducible and can be used as the quality control of salvianolic acid B in Jianyao Migu tablets and can better guarantee the overall quality of the preparation and has strong practicability.
KEy WORDS Jianyao Migu tablets； salvianolic acid B； thin-layer chromatography； HPLC
健腰密骨片是由上海市名中醫、上海中医药大学附属龙华医院施杞教授在继承石氏伤科“以气为主、以血为先”理论精髓的基础上，结合50多年临床实践的经验总结方，该方由黄芪、淫羊藿、墨旱莲、丹参等6味中药组成，具有“益气健腰补肾，化瘀通络止痛”的功效。方中黄芪为君药，补中益气，利水消肿，标本兼顾。淫羊藿为臣药，发挥其补肾壮阳、强筋续骨、祛风除湿的功效，上述两味药在制剂质量标准开发过程中已建立定量检测质量控制标准。
丹参具有活血调经，祛瘀止痛，凉血消痈，清心除烦，养血安神等功效。丹酚酸B为《中国药典》2015年版一部丹参含量测定项检测物质之一[1-2]。虽然已有很多文献已对丹参及丹酚酸B的含量测定方法进行研究报道[3-5]，但作为复方健腰密骨片的使药，其质量也应进行检测以保证复方药效的稳定，从而协助君、臣药以加强治疗作用，也可直接治疗次要兼证。本文通过试验摸索拟建立健腰密骨片中丹参的薄层色谱鉴别方法和丹酚酸B的高效液相色谱含量测定方法，利用新建立的薄层鉴别方法和含量测定方法完善质量标准，为制剂的全方位质量控制提供参考。
1 材料和方法
1.1 仪器与试药
1200高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；实验室专用超纯水机（重庆利迪现代水技术设备有限公司）；Mettler Toledo AL204天平、Mettler Toledo XS205天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；电热恒温水浴锅HHS型（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；真空干燥烘箱（上海一恒科学仪器有限公司）；超声机SK-7210HP（上海科导超声仪器有限公司）。
德国默克硅胶板G60（10 cm×10 cm），购自默克化工技术（上海）有限公司；丹酚酸B对照品（批号：11562-201716，供含量测定用，含量以94.1%计）和丹参对照药材（批号：120923-201615，供薄层鉴别用），均购自中国食品药品检定研究院；健腰密骨片（批号：S180501、S19110101、S19110102、S19110401、S19110402、S191102）由上海和黄药业有限公司提供；乙腈为色谱纯试剂（Dikma公司）；水为超纯水；磷酸为色谱纯试剂；其它试剂均为分析纯。 1.2 方法
1.2.1 丹酚酸B薄层鉴别
1）薄层鉴别供试品溶液 取健腰密骨片适量，研细，取5 g，加甲醇50 mL，超声处理（功率350 W，频率53 kHz）30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水30 mL使溶解，用盐酸调节pH至2～3，用乙醚振摇提取2次，每次20 mL（乳化層转移至水层），合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为不同批号薄层鉴别供试品溶液1～5。
2）薄层鉴别丹酚酸B对照品溶液 取丹酚酸B对照品，加甲醇制成每1 mL含2 mg的溶液，作为薄层鉴别丹酚酸B对照品溶液。
3）薄层鉴别丹参对照药材和薄层鉴别阴性溶液 另取丹参对照药材1 g，加甲醇50 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣以甲醇1 mL溶解作为薄层鉴别丹参对照药材溶液。按处方比例，除去丹参，按处方制得薄层鉴别丹参阴性对照样品，按供试品溶液制备方法，同法制得薄层鉴别丹参阴性溶液。
4）薄层色谱法 取各薄层鉴别受试溶液5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上[2]，以甲苯-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（4∶6∶8∶1∶4）为展开剂，预平衡15 min后放入硅胶板，展层后取出，晾干，喷5%三氯化铁乙醇溶液，于105 ℃加热至斑点显色清晰。
1.2.2 丹酚酸B含量测定
1.2.2.1 色谱条件
Agilent TC C18柱（4.6 mm×250 mm，5 mm）；以乙腈-0.1%磷酸水溶液（22∶78）为流动相，流速1.0 mL/min；检测波长286 nm；柱温25 ℃；进样量10 mL。
1.2.2.2 溶液制备
1）对照品溶液 精密称定丹酚酸B对照品（含量以94.1%计）15.94 mg，置于10 mL容量瓶中，加60%甲醇溶解并稀释定容至刻度，摇匀，即得每1 mL含0.15 mg的丹酚酸B对照品溶液。
2）供试品溶液 精密称定健腰密骨片1.5 g，置具塞三角锥形瓶中，加入60%甲醇50 mL后称重；超声提取30 min，放冷，再称重，用60%甲醇补足减少的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
3）阴性样品溶液 按健腰密骨片的处方制得不含丹参的阴性样品，按供试品溶液处理方法制备阴性样品溶液。
2 结果
2.1 薄层鉴别
薄层鉴别供试品与薄层鉴别丹酚酸B对照品、薄层鉴别丹参对照药材在薄层色谱的相同位置显示相同颜色的斑点，而薄层鉴别丹参阴性对照无斑点，表明阴性对照对薄层色谱没有干扰（图1）。
2.2 专属性试验
取对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各10 mL进样测定，阴性样品溶液在对照品相同的保留时间处未见色谱峰，说明对色谱测定无干扰（图2）。
2.3 线性关系考察
分别配制质量浓度为19.1、38.2、76.5、152.9、305.8、611.6、1 529.1 mg/mL丹酚酸B溶液，进样测定峰面积，并以峰面积为纵坐标（Y），以进样量（mg）为横坐标（X）绘制标准曲线并进行线性回归，得回归方程为：Y=1 190.30X-253.63 r=0.999 9。结果表明丹酚酸B在0.191～15.291 μg范围内线性关系良好。
2.4 精密度试验
取供试品溶液重复进样6次，测定峰面积并计算其RSD。结果丹酚酸B RSD为0.07%，表明该测定方法精密度良好。
2.5 重复性试验
取同一批号的健腰密骨片平行制备6份供试品溶液，色谱测定并计算丹酚酸B含量，其平均含量为4.93 mg/mL，RSD为0.84%，表明该方法的重复性良好。
2.6 加样回收率试验
精密称定含量已知的同一批健腰密骨片（批号S180501）样品9份，按约为样品丹酚酸B含量的0.8、1.0、1.2倍量分别加入对照品适量，进样测定并计算回收率，结果表明平均回收率为96.72%、RSD为1.46（表1）。
2.7 稳定性试验
取同一份供试品溶液置于室温（25 ℃），分别于0、2、4、6、8、10、12、24、48 h进样测定，记录丹酚酸B的峰面积。经计算其RSD为1.25%，表明供试品溶液在48 h内稳定。
2.8 含量测定
对3批健腰密骨片样品中的丹酚酸B含量进行测定，结果表明，丹酚酸B含量相对稳定，质量可控（表2）。
3 讨论
在复方中药新药研制过程中，小试研究、中试放大以及向大生产转化时，通常会碰到三个问题：①大生产浸膏得率比小试、中试得率高，导致浸膏粉物料性质有差异，影响制剂成型过程和稳定性，并影响制剂的制成量，从而影响制剂规格；②由于大生产是连续化生产线生产，工艺参数不同于实验室，因此需要考虑复方中质量标准制定的全覆盖及合理性；③大生产需要考虑安全、清洁、环保、节能和易操作。正因为上述原因，研究并完善复方中的质量标准全覆盖对新药成果的产业化转化显得非常必要。
本研究通过调节pH使丹酚酸B充分转移至乙醚层，实现快速分离；所建立的薄层鉴别方法比文献[6-7]操作简便，可用于复方健腰密骨片中丹参药材的专属鉴别；所建立的HPLC含量测定方法所用时间较文献报道短[8]、流动相配比简单更具有实用性，具有基本配置的高效液相色谱仪即可满足测定需求，便于方法转移。在供试品制备方法考察试验中，曾比较20%、40%、60%和80%甲醇对丹酚酸B提取收率的影响，结果表明60%甲醇提取收率最高；也试验了不同提取时间（15、30、45及60 min）对提取收率的影响，结果显示30 min能有效提取丹酚酸B，故本试验选择60%甲醇超声提取30 min。
丹酚酸B作为丹参药材含量检测的成分之一，已有多年的研究基础。本研究以复方健腰密骨片为样品，以使药丹参质量监控为目标，建立用于复方制剂质量检测的定性薄层层析鉴别方法和定量HPLC含量测定方法，以便达到复方制剂质量可控的目的，为该品种的全方位质量控制提供参考。
参考文献
[1] 程显隆， 王峰， 冯玉飞， 等. 丹参中丹酚酸B的高效液相色谱法含量测定[J]. 药物分析杂志， 2003， 23（2）： 149-150.
[2] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典2015年版一部[M]. 北京： 中国医药科技出版社， 2015： 76.
[3] 涂元红， 金阳， 刘文. HPLC法测定复方降脂茶中丹酚酸B的含量[J]. 贵阳中医药学报， 2017， 39（4）： 24-25.
[4] 剧梦真， 桂双英， 韩兴邦， 等. 丹参破壁饮片的质量研究[J]. 贵阳中医学院学报， 2019， 41（6）： 16-23.
[5] 何银舟， 胡正明， 程建明， 等. 丹参总酚酸滴丸的制备及质量评价[J]. 中成药， 2019， 41（10）： 2319-2323.
[6] 汪祺， 孙磊， 郑笑为， 等. 冠脉宁片（胶囊）现行标准中丹参薄层鉴别比较研究[J]. 时珍国医国药， 2014， 25（11）： 2667-2669.
[7] 吴笛， 王德勤， 李楚源. 复方丹参片薄层色谱鉴别方法研究[J]. 药物分析杂志， 2012， 32（9）： 1658-1660.
[8] 董赛文. HPLC法测定参梅养胃颗粒中丹酚酸B的含量[J]. 北方药学， 2017， 14（12）： 1-2.
关键词 健腰密骨片 丹酚酸B 薄层色谱鉴别 高效液相色谱
中图分类号：R927.2； R286 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2021）13-0073-04
Establishment of a quality control method for the determination of salvianolic acid B in Jianyao Migu tablets
ZHAO Xiaoling， SHANG Xiaohui， ZHAN Changsen
（Shanghai Hutchison Pharmaceuticals， Shanghai 201401， China）
ABSTRACT Objective： To establish a quality control method of salvianolic acid B in Jianyao Migu tablets. Methods： A thin-layer chromatography （TLC） method for qualitative identification and an HPLC method for the quantitative determination of salvianolic acid B were established by condition tests. Results： Salvianolic acid B in the preparation showed a clear spot on TLC， which was reproducible and specific without the interference of negative control. The calibration curve of salvianolic acid B by HPLC was linear in the range of 0.191-15.291 μg and regression equation was Y=1 190.30X-253.63， r=0.999 9. The average recovery ratio was 96.72% and the relative standard deviation was 1.46%. Conclusion： The established new methods are simple， rapid， accurate and reproducible and can be used as the quality control of salvianolic acid B in Jianyao Migu tablets and can better guarantee the overall quality of the preparation and has strong practicability.
KEy WORDS Jianyao Migu tablets； salvianolic acid B； thin-layer chromatography； HPLC
健腰密骨片是由上海市名中醫、上海中医药大学附属龙华医院施杞教授在继承石氏伤科“以气为主、以血为先”理论精髓的基础上，结合50多年临床实践的经验总结方，该方由黄芪、淫羊藿、墨旱莲、丹参等6味中药组成，具有“益气健腰补肾，化瘀通络止痛”的功效。方中黄芪为君药，补中益气，利水消肿，标本兼顾。淫羊藿为臣药，发挥其补肾壮阳、强筋续骨、祛风除湿的功效，上述两味药在制剂质量标准开发过程中已建立定量检测质量控制标准。
丹参具有活血调经，祛瘀止痛，凉血消痈，清心除烦，养血安神等功效。丹酚酸B为《中国药典》2015年版一部丹参含量测定项检测物质之一[1-2]。虽然已有很多文献已对丹参及丹酚酸B的含量测定方法进行研究报道[3-5]，但作为复方健腰密骨片的使药，其质量也应进行检测以保证复方药效的稳定，从而协助君、臣药以加强治疗作用，也可直接治疗次要兼证。本文通过试验摸索拟建立健腰密骨片中丹参的薄层色谱鉴别方法和丹酚酸B的高效液相色谱含量测定方法，利用新建立的薄层鉴别方法和含量测定方法完善质量标准，为制剂的全方位质量控制提供参考。
1 材料和方法
1.1 仪器与试药
1200高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；实验室专用超纯水机（重庆利迪现代水技术设备有限公司）；Mettler Toledo AL204天平、Mettler Toledo XS205天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；电热恒温水浴锅HHS型（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；真空干燥烘箱（上海一恒科学仪器有限公司）；超声机SK-7210HP（上海科导超声仪器有限公司）。
德国默克硅胶板G60（10 cm×10 cm），购自默克化工技术（上海）有限公司；丹酚酸B对照品（批号：11562-201716，供含量测定用，含量以94.1%计）和丹参对照药材（批号：120923-201615，供薄层鉴别用），均购自中国食品药品检定研究院；健腰密骨片（批号：S180501、S19110101、S19110102、S19110401、S19110402、S191102）由上海和黄药业有限公司提供；乙腈为色谱纯试剂（Dikma公司）；水为超纯水；磷酸为色谱纯试剂；其它试剂均为分析纯。 1.2 方法
1.2.1 丹酚酸B薄层鉴别
1）薄层鉴别供试品溶液 取健腰密骨片适量，研细，取5 g，加甲醇50 mL，超声处理（功率350 W，频率53 kHz）30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水30 mL使溶解，用盐酸调节pH至2～3，用乙醚振摇提取2次，每次20 mL（乳化層转移至水层），合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为不同批号薄层鉴别供试品溶液1～5。
2）薄层鉴别丹酚酸B对照品溶液 取丹酚酸B对照品，加甲醇制成每1 mL含2 mg的溶液，作为薄层鉴别丹酚酸B对照品溶液。
3）薄层鉴别丹参对照药材和薄层鉴别阴性溶液 另取丹参对照药材1 g，加甲醇50 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣以甲醇1 mL溶解作为薄层鉴别丹参对照药材溶液。按处方比例，除去丹参，按处方制得薄层鉴别丹参阴性对照样品，按供试品溶液制备方法，同法制得薄层鉴别丹参阴性溶液。
4）薄层色谱法 取各薄层鉴别受试溶液5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上[2]，以甲苯-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（4∶6∶8∶1∶4）为展开剂，预平衡15 min后放入硅胶板，展层后取出，晾干，喷5%三氯化铁乙醇溶液，于105 ℃加热至斑点显色清晰。
1.2.2 丹酚酸B含量测定
1.2.2.1 色谱条件
Agilent TC C18柱（4.6 mm×250 mm，5 mm）；以乙腈-0.1%磷酸水溶液（22∶78）为流动相，流速1.0 mL/min；检测波长286 nm；柱温25 ℃；进样量10 mL。
1.2.2.2 溶液制备
1）对照品溶液 精密称定丹酚酸B对照品（含量以94.1%计）15.94 mg，置于10 mL容量瓶中，加60%甲醇溶解并稀释定容至刻度，摇匀，即得每1 mL含0.15 mg的丹酚酸B对照品溶液。
2）供试品溶液 精密称定健腰密骨片1.5 g，置具塞三角锥形瓶中，加入60%甲醇50 mL后称重；超声提取30 min，放冷，再称重，用60%甲醇补足减少的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
3）阴性样品溶液 按健腰密骨片的处方制得不含丹参的阴性样品，按供试品溶液处理方法制备阴性样品溶液。
2 结果
2.1 薄层鉴别
薄层鉴别供试品与薄层鉴别丹酚酸B对照品、薄层鉴别丹参对照药材在薄层色谱的相同位置显示相同颜色的斑点，而薄层鉴别丹参阴性对照无斑点，表明阴性对照对薄层色谱没有干扰（图1）。
2.2 专属性试验
取对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各10 mL进样测定，阴性样品溶液在对照品相同的保留时间处未见色谱峰，说明对色谱测定无干扰（图2）。
2.3 线性关系考察
分别配制质量浓度为19.1、38.2、76.5、152.9、305.8、611.6、1 529.1 mg/mL丹酚酸B溶液，进样测定峰面积，并以峰面积为纵坐标（Y），以进样量（mg）为横坐标（X）绘制标准曲线并进行线性回归，得回归方程为：Y=1 190.30X-253.63 r=0.999 9。结果表明丹酚酸B在0.191～15.291 μg范围内线性关系良好。
2.4 精密度试验
取供试品溶液重复进样6次，测定峰面积并计算其RSD。结果丹酚酸B RSD为0.07%，表明该测定方法精密度良好。
2.5 重复性试验
取同一批号的健腰密骨片平行制备6份供试品溶液，色谱测定并计算丹酚酸B含量，其平均含量为4.93 mg/mL，RSD为0.84%，表明该方法的重复性良好。
2.6 加样回收率试验
精密称定含量已知的同一批健腰密骨片（批号S180501）样品9份，按约为样品丹酚酸B含量的0.8、1.0、1.2倍量分别加入对照品适量，进样测定并计算回收率，结果表明平均回收率为96.72%、RSD为1.46（表1）。
2.7 稳定性试验
取同一份供试品溶液置于室温（25 ℃），分别于0、2、4、6、8、10、12、24、48 h进样测定，记录丹酚酸B的峰面积。经计算其RSD为1.25%，表明供试品溶液在48 h内稳定。
2.8 含量测定
对3批健腰密骨片样品中的丹酚酸B含量进行测定，结果表明，丹酚酸B含量相对稳定，质量可控（表2）。
3 讨论
在复方中药新药研制过程中，小试研究、中试放大以及向大生产转化时，通常会碰到三个问题：①大生产浸膏得率比小试、中试得率高，导致浸膏粉物料性质有差异，影响制剂成型过程和稳定性，并影响制剂的制成量，从而影响制剂规格；②由于大生产是连续化生产线生产，工艺参数不同于实验室，因此需要考虑复方中质量标准制定的全覆盖及合理性；③大生产需要考虑安全、清洁、环保、节能和易操作。正因为上述原因，研究并完善复方中的质量标准全覆盖对新药成果的产业化转化显得非常必要。
本研究通过调节pH使丹酚酸B充分转移至乙醚层，实现快速分离；所建立的薄层鉴别方法比文献[6-7]操作简便，可用于复方健腰密骨片中丹参药材的专属鉴别；所建立的HPLC含量测定方法所用时间较文献报道短[8]、流动相配比简单更具有实用性，具有基本配置的高效液相色谱仪即可满足测定需求，便于方法转移。在供试品制备方法考察试验中，曾比较20%、40%、60%和80%甲醇对丹酚酸B提取收率的影响，结果表明60%甲醇提取收率最高；也试验了不同提取时间（15、30、45及60 min）对提取收率的影响，结果显示30 min能有效提取丹酚酸B，故本试验选择60%甲醇超声提取30 min。
丹酚酸B作为丹参药材含量检测的成分之一，已有多年的研究基础。本研究以复方健腰密骨片为样品，以使药丹参质量监控为目标，建立用于复方制剂质量检测的定性薄层层析鉴别方法和定量HPLC含量测定方法，以便达到复方制剂质量可控的目的，为该品种的全方位质量控制提供参考。
参考文献
[1] 程显隆， 王峰， 冯玉飞， 等. 丹参中丹酚酸B的高效液相色谱法含量测定[J]. 药物分析杂志， 2003， 23（2）： 149-150.
[2] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典2015年版一部[M]. 北京： 中国医药科技出版社， 2015： 76.
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[7] 吴笛， 王德勤， 李楚源. 复方丹参片薄层色谱鉴别方法研究[J]. 药物分析杂志， 2012， 32（9）： 1658-1660.
[8] 董赛文. HPLC法测定参梅养胃颗粒中丹酚酸B的含量[J]. 北方药学， 2017， 14（12）： 1-2.